Replication fork repriming versus reversal

点击翻译按钮获取中文摘要

Summary: The objective of this proposal is to understand the mechanisms that govern DNA replication fork  stability  upon  treatment  with  multiple-­drug  doses  in  BRCA-­mutant  tumors.  Mutations  in  the  breast  cancer  susceptibility  genes  BRCA1  and  BRCA2  are  associated  with  several  forms  of  cancer,  including  breast  and  ovarian cancers. BRCA proteins are required for the maintenance of replication fork stability following treatment  with chemotherapeutics such as cisplatin, a DNA cross-­liking agent widely used for cancer treatment. Replication  forks can reverse to aid the repair of DNA damage induced by chemotherapeutics and BRCA proteins are key  to  protecting  the  reversed  structures  from  nucleolytic  degradation.  In  absence  of  BRCA,  reversed  replication  forks are extensively degraded by nucleases, leading to chemosensitivity. However, the molecular basis of the  DNA-­damaging  drug  sensitivity  in BRCA-­mutant  tumors  remain unclear.  Defining  these  mechanisms  is  crucial  for basic research to inform and improve current clinical oncology regimens based on DNA replication inhibitors.   Most  studies  focus  on  the  analysis  of  replication  perturbations  following  a  single-­dose  treatment.  For  the  first  time, we investigated replication fork perturbations in BRCA1-­deficient cells treated with cisplatin 24 hours after  pre-­exposure  to  this  drug.  Our  preliminary  data  challenge  the  dogma  that  DNA-­damaging  drug  sensitivity  originates from the extended replication fork degradation phenotype observed after a single-­dose treatment in  BRCA1-­deficient  cells.  We  found  that  fork  degradation  is  no  longer  detectable  when  using  multiple  cisplatin  doses. This effect depends on the overexpression and DNA primase activity of the PrimPol polymerase. Based  on  this  premise,  we  hypothesize  that  a  PrimPol-­dependent  pathway  rescues  replication  fork  degradation  following multiple rounds of cisplatin treatment and modulates cisplatin sensitivity in BRCA1-­deficient cells. We  also posit that cancer cell reliance on fork repriming is enhanced under any condition that leads to reversed fork  degradation¾e.g., BRCA1 or BRCA2 protein deficiency.   Aim  1  will  define  the  function  of  the  dual  enzymatic  activity  of  PrimPol  in  replication  fork  stability  in  BRCA1-­ deficient cells following treatment with multiple cisplatin doses. Aim 2 will determine whether PrimPol-­mediated  repriming  rescues  fork  degradation  by  suppressing  fork  reversal,  which  would  otherwise  lead  to  extensive  nascent strand degradation in BRCA-­mutants. Aim 3 will determine the impact of the cisplatin-­induced PrimPol  overexpression on genomic instability and BRCA1-­deficent cancer cell viability. This will be achieved by using a  unique  combination  of  single-­molecule  DNA  replication  and  electron  microscopy  approaches  available  in  our  laboratory. These studies will establish a new paradigm for the PrimPol polymerase in replication fork protection  and  genomic  stability.  They  will  also  introduce  the  novel  concept  that  multiple-­drug  doses  need  to  be  used  to  fully  understand  how  cells  respond  to  chemotherapeutics,  and  they  will  offer  new  insights  for  the  treatment  of  BRCA-­mutant cancer patients by targeting the PrimPol-­dependent pathway.