Replication fork repriming versus reversal

摘要：这项提案的目的是了解DNA复制叉的调控机制， 在BRCA-DR突变型肿瘤中使用多剂量抗肿瘤药物治疗后的稳定性。 乳腺癌中的突变 易感基因BRCA 1和BRCA 2与几种癌症有关，包括乳腺癌和 卵巢癌BRCA蛋白是治疗后维持复制叉稳定性所必需的 化疗药物如顺铂，一种广泛用于癌症治疗的DNA交联剂。复制 叉可以逆转，以帮助修复化疗药物诱导的DNA损伤，BRCA蛋白是关键 以保护反转结构免于核分解降解。 在没有BRCA的情况下，逆转复制 叉被核酸酶广泛降解，导致化学敏感性。然而， BRCA-β突变型肿瘤对DNA损伤的药物敏感性仍不清楚. 定义这些机制至关重要 用于基础研究，以告知和改进基于DNA复制抑制剂的当前临床肿瘤学方案。 大多数研究集中在分析单次给药后的复制扰动。 第一 同时，我们研究了顺铂处理后24小时BRCA 1-β 2缺陷细胞中复制叉的扰动， 暴露在这种药物中。 我们的初步数据挑战了DNA损伤药物敏感性的教条 来源于单次给药后观察到的延长复制叉降解表型。 BRCA 1-β缺陷细胞。 我们发现，叉降解不再是检测时，使用多个顺铂 剂量这种效应取决于PrimPol聚合酶的过表达和DNA引发酶活性。基于 在此前提下，我们假设PrimPol依赖性途径挽救了复制叉的降解 在多轮顺铂治疗后，其在BRCA 1-β缺陷细胞中调节顺铂敏感性。我们 还证实，在任何导致反向分叉的条件下，癌细胞对分叉再引发的依赖性都会增强。 降解例如，BRCA 1或BRCA 2蛋白缺乏症。 目的1将定义PrimPol的双重酶活性在BRCA 1-BRCA 2中复制叉稳定性中的功能。 在用多个顺铂剂量处理后缺乏细胞。目标2将确定PrimPol-1介导的 重新启动通过抑制分叉反转来挽救分叉退化，否则会导致广泛的 BRCA-10突变体中的新生链降解。目的3将确定顺铂-顺铂诱导的PrimPol 过表达对基因组不稳定性和BRCA 1-β缺陷癌细胞活力的影响。这将通过使用 独特的单克隆分子DNA复制和电子显微镜方法的组合，可在我们的 实验室这些研究将为PrimPol聚合酶在复制叉保护中建立新的范例 和基因组稳定性。 他们还将介绍一种新的概念，即需要使用多种剂量的药物， 完全了解细胞如何对化疗药物作出反应，他们将为治疗 BRCA-p53基因突变的癌症患者通过靶向PrimPol-p53依赖性途径。

Summary: The objective of this proposal is to understand the mechanisms that govern DNA replication fork  stability  upon  treatment  with  multiple-­drug  doses  in  BRCA-­mutant  tumors.  Mutations  in  the  breast  cancer  susceptibility  genes  BRCA1  and  BRCA2  are  associated  with  several  forms  of  cancer,  including  breast  and  ovarian cancers. BRCA proteins are required for the maintenance of replication fork stability following treatment  with chemotherapeutics such as cisplatin, a DNA cross-­liking agent widely used for cancer treatment. Replication  forks can reverse to aid the repair of DNA damage induced by chemotherapeutics and BRCA proteins are key  to  protecting  the  reversed  structures  from  nucleolytic  degradation.  In  absence  of  BRCA,  reversed  replication  forks are extensively degraded by nucleases, leading to chemosensitivity. However, the molecular basis of the  DNA-­damaging  drug  sensitivity  in BRCA-­mutant  tumors  remain unclear.  Defining  these  mechanisms  is  crucial  for basic research to inform and improve current clinical oncology regimens based on DNA replication inhibitors.   Most  studies  focus  on  the  analysis  of  replication  perturbations  following  a  single-­dose  treatment.  For  the  first  time, we investigated replication fork perturbations in BRCA1-­deficient cells treated with cisplatin 24 hours after  pre-­exposure  to  this  drug.  Our  preliminary  data  challenge  the  dogma  that  DNA-­damaging  drug  sensitivity  originates from the extended replication fork degradation phenotype observed after a single-­dose treatment in  BRCA1-­deficient  cells.  We  found  that  fork  degradation  is  no  longer  detectable  when  using  multiple  cisplatin  doses. This effect depends on the overexpression and DNA primase activity of the PrimPol polymerase. Based  on  this  premise,  we  hypothesize  that  a  PrimPol-­dependent  pathway  rescues  replication  fork  degradation  following multiple rounds of cisplatin treatment and modulates cisplatin sensitivity in BRCA1-­deficient cells. We  also posit that cancer cell reliance on fork repriming is enhanced under any condition that leads to reversed fork  degradation¾e.g., BRCA1 or BRCA2 protein deficiency.   Aim  1  will  define  the  function  of  the  dual  enzymatic  activity  of  PrimPol  in  replication  fork  stability  in  BRCA1-­ deficient cells following treatment with multiple cisplatin doses. Aim 2 will determine whether PrimPol-­mediated  repriming  rescues  fork  degradation  by  suppressing  fork  reversal,  which  would  otherwise  lead  to  extensive  nascent strand degradation in BRCA-­mutants. Aim 3 will determine the impact of the cisplatin-­induced PrimPol  overexpression on genomic instability and BRCA1-­deficent cancer cell viability. This will be achieved by using a  unique  combination  of  single-­molecule  DNA  replication  and  electron  microscopy  approaches  available  in  our  laboratory. These studies will establish a new paradigm for the PrimPol polymerase in replication fork protection  and  genomic  stability.  They  will  also  introduce  the  novel  concept  that  multiple-­drug  doses  need  to  be  used  to  fully  understand  how  cells  respond  to  chemotherapeutics,  and  they  will  offer  new  insights  for  the  treatment  of  BRCA-­mutant cancer patients by targeting the PrimPol-­dependent pathway.