Molecular Basis of the Tau Aggregation Pathway

项目摘要 Tau是一种微管蛋白稳定蛋白，在神经元中含量丰富.它是一种高度可溶的，本质上无序的 在天然条件下几乎没有聚集倾向的蛋白质（IDP）。然而，在几个实验 在多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病中，Tau可以从 细胞与细胞之间，并聚集成细胞内β-淀粉样折叠纤维状沉积物。 我们的实验室有了关键的新数据 关于时间，结构和细胞生物学的细节，Tau错误折叠和流体相组装， 这一提议的基础。 我们的研究团队由一名细胞生物学家，一名物理化学家和一名理论专家组成。 生物药剂学家我们以迭代的方式密切合作， 与疾病相关的Tau纤维。用于这种分析的工具包括（a）能够解决 基于多种分子探针的体内Tau相互作用和间接其构象状态; 定向自旋标记、电子顺磁共振（EPR）线形分析和脉冲偶极EPR， 确定Tau的构象特征;以及（c）IDP构象的完全原子建模，其 种群和能量学，以及Tau高级组装的粗粒模拟。概念 该提案的流程始于汉实验室的一项引人注目的观察：当暴露在低于化学计量比的环境中时， 大量的肝素，Tau的片段显著地延伸了一个纳米到溶剂中，从而暴露了疏水的 PHF 6（*）片段能够堆叠成整齐的β-环糊精片层。 这一观察结果与以下现象有关： 纤维，因此我们将该起始步骤称为“途径上”接种。在体内，已知Tau在大量的 通过选择性剪接、突变和翻译后修饰控制构象景观。我们 我建议IDP Tau以不同的聚集方式填充不同构象的系综 倾向，原纤维形态和相互作用伴侣，这取决于确切的Tau变体。 但 在该集合中的定义和特定构象特征是未知的。 确定 聚集的构象特征-倾向于Tau变体是我们的核心目标，而缺失的拼图 将Tau构象与细胞相互作用联系起来的关键是聚集中间体的存在和性质。 在这种情况下，Han实验室发现RNA诱导Tau在体外形成蛋白质的液-液相分离 液滴通过微弱的静电力结合在一起。在体内细胞水平，Kosik实验室发现了Tau-β tRNA复合物，从而将Tau添加到参与神经变性的越来越多的RNA-tRNA结合蛋白的列表中， 并且能够在细胞质中建立液-液两相分离。Tau-β-tRNA复合物可以是一种蛋白质。 生理或病理实体-我们将通过确定它们在神经元细胞中的位点来获得线索。 最后我们 我打算了解Tau蛋白的构象是否受疾病突变或协同因子的调节， Tau-β-tRNA复合物的稳定性和体内定位性。我们的目标是找出一条详细的路线 从Tau到纤维，从纳米到细胞水平，并发现Tau聚集的病理实体。

PROJECT SUMMARY      Tau is a microtubule-­stabilizing protein that is abundant in neurons. It is a highly soluble, intrinsically disordered  protein (IDP) with little tendency for aggregation under native conditions. However, under several experimental  conditions and in a variety of neurodegenerative disorders including Alzheimer’s disease, Tau can spread from  cell  to  cell  and  aggregates  as  intra-­cellular  β-­sheet  fibrilar  deposits.  Our  laboratories  have  critical  new  data  concerning the temporal, structural and cell biological details of Tau misfolding and fluid-­phase assembly—the  basis  of  this  proposal.  Our  research  team  consists  of  a  cell  biologist,  a  physical  chemist,  and  a  theoretical  biophysicist. Working together closely in an iterative manner we intend to determine the pathway from normal  Tau to disease-­related Tau fibrils. The tools for this analysis include (a) cellular systems capable of addressing  in vivo Tau interactions, and indirectly its conformational state based on a variety of molecular probes;; (b) site-­ directed spin labeling, electron paramagnetic resonance (EPR) line shape analysis and pulsed dipolar EPR to  determine  conformational  signatures  of  Tau;;  and  (c)  fully  atomistic  modeling  of  IDP  conformations,  their  populations and energetics, and coarse-­grained simulation of higher-­order assemblies of Tau. The conceptual  flow of the proposal begins with a remarkable observation from the Han lab: When exposed to sub-­stoichiometric  amounts of heparin, segments of Tau dramatically extend by a nanometer to solvent-­expose the hydrophobic  PHF6(*)  segment  capable  of  stacking  into  neat  β-­sheets.  This  observation  correlates  with  the  appearance  of  fibrils, and thus we refer to this initiating step as “on pathway” seeding. In vivo, Tau is known to populate a vast  conformational landscape controlled by alternative splicing, mutations and post-­translational modifications. We  propose  that  the  IDP  Tau  populates  an  ensemble  of  different  conformations  with  different  aggregation  propensities,  fibril  morphologies  and  interaction  partners,  depending  on  the  exact  Tau  variant.  However,  the  defining  and  specific  conformational  signatures  within  this  ensemble  are  unknown.  Determining  the  conformational signatures of aggregation-­prone Tau variants is our core objective, while a missing puzzle piece  in connecting Tau conformation to cellular interactions is the existence and nature of aggregation intermediates.  In this vein, the Han lab discovered that RNA induces liquid-­liquid phase separation of Tau in vitro into protein  droplets held together by weak electrostatic forces. At the in vivo cellular level, the Kosik lab discovered Tau-­ tRNA complexes, thereby adding Tau to the growing list of RNA-­binding proteins involved in neurodegeneration,  and capable of establishing liquid-­liquid phase separation in the cytoplasm. The Tau-­tRNA complexes may be a  physiologic  or  pathological  entity—we  will  obtain  clues  by  determining  their  loci  in  neuronal  cells.  Finally,  we  intend to learn whether the conformation of Tau, as modulated by disease mutations or co-­factors, influences  the stability and in vivo locality of the Tau-­tRNA complexes. Our goal is to discover a detailed route from soluble  Tau to fibrils, from the nanometer to the cellular level, and discover the pathological entities of Tau aggregation.