Optic Stalk-Disc Development and Differentiation

项目摘要 这项建议调查的根本原因，人类眼部疾病使用小鼠 模型所提出的实验将使用复杂的体内条件（cre-β-lox）小鼠遗传学， 小鼠转基因，组织学，免疫组织化学，共聚焦显微镜，原位杂交， 小鼠胚胎学，单细胞NEXTgen测序，生物信息学，BAC重组工程， qPCR和PCR技术，以解决有关视柄-视神经盘的基本机制问题 发育和星形胶质细胞分化。 Pax 2转录因子启动表达， 所有视泡细胞，但逐渐仅限于正在形成的视盘， 茎 与其在其他胚胎组织中的作用一致，我们将检验Pax 2 通过与细胞表观遗传学的全球相互作用关闭神经/视网膜祖细胞基因程序， 机械. 这种活性最初将眼细胞限制为星形胶质细胞祖细胞（APC）的命运， 调节其细胞分裂速率，并启动神经胶质基因表达谱。 在目标1中，我们 测试进化上保守的Pax 2非编码序列作为长期寻找的视盘神经 通过创建一个新的Pax 2-PaxCre驱动程序来增强。此工具将用于有条件地删除 Hes 1的表达，并评估其对视柄发育、APC分化和成熟的影响。 星形胶质细胞功能 对于目标2，我们将利用先前特征化的Rax-ε Cre BAC转基因小鼠系，Pax 2GFP敲除蛋白和新的Pax 2 floxed等位基因，以跟踪眼 对照和Pax 2条件突变细胞中的GFP谱系。 我们还将生成和 比较Pax 2 E11和E12杂合子和纯合子的基因表达谱 变异的眼睛 在这里，我们将使用单细胞RNA测序和日益丰富的公共 关于染色质构型和mRNA表达水平的可用信息， 小鼠眼细胞的正常发育。

Project Summary    This proposal investigates the underlying causes of human ocular diseases using mouse  models. Proposed experiments will use complex in vivo conditional (cre-­lox) mouse genetics,  mouse transgenics, histology, immunohistochemistry, confocal microscopy, in situ hybridization,  mouse embryology, single-­cell NEXTgen sequencing, bioinformatics, BAC recombineering,  qPCR, and PCR technologies to address basic, mechanistic questions about optic stalk-­disc  development and astrocyte differentiation.  The Pax2 transcription factor initiates expression in  all optic vesicle cells, but becomes progressively restricted to only the forming optic disc and  stalk.  Consistent with its role in other embryonic tissues, we will test a hypothesis that Pax2  shuts off neural/retinal progenitor gene programs, via global interactions with cell epigenetic  machinery.  This activity initially restricts ocular cells to an astrocytic progenitor cell (APC) fate,  regulates their rate of cell division, and initiates glial gene expression profiles.  In Aim 1, we will  test evolutionarily-­conserved Pax2 noncoding sequences as long-­sought optic disc-­nerve  enhancer(s) by creating a new Pax2-­Cre driver. This tool will be used to conditionally remove  Hes1 and assess the consequences to optic stalk development, APC differentiation and mature  astrocyte functionality.  For Aim 2, we will take advantage of previously characterized Rax-­Cre  BAC transgenic mouse line, Pax2GFP knock-­in and new Pax2 floxed allele to follow the ocular  GFP lineages in control and Pax2 conditionally mutant cells.  We will also generate and  compare the gene expression profiles of Pax2 E11 and E12 heterozygous and homozygous  mutant eyes.  Here we will use single-­cell RNA sequencing and the growing wealth of publicly  available information regarding chromatin configurations, and mRNA expression levels during  the normal development of mouse ocular cells.