Metallobiochemistry of Mn/Fe protein cofactors

项目总结/摘要 这项研究计划将建立新发现的基本化学原理， Mn/Fe蛋白。 这些蛋白质的活性位点与传统的无机智慧相悖， 组装一个含有两种不同过渡金属的配位几乎相同的辅因子 环境. 组装后，氧在金属中心被激活， 电子氧化反应，通过分子间电子转移发生再生。 不像井里 研究了二铁酶同系物，Mn/Fe蛋白中这些过程的分子水平细节仍然存在 未知 由于含Mn/Fe ~（2+）的蛋白质主要在极端嗜热菌和致病菌中被鉴定， 微生物，包括衣原体和分枝杆菌的许多物种，已经提出， 杂环化辅因子可以提供对活性氮和/或氧物质抗性，所述活性氮和/或氧物质 宿主的免疫系统拟议的研究将使用R2 lox蛋白作为模型来探索这一假设 支架，检查Mn/Fe辅因子相对于二铁位点的反应性。 PI的初步研究 表明R2 lox的有氧组装通过两个不同的中间体进行，通过时间分辨鉴定 光学和EPR光谱学。 拟议的工作将使用一系列光谱技术，包括 光学，共振拉曼，CW-拉曼和脉冲EPR，和穆斯堡尔，以阐明电子和几何 这些中间体的结构。 围绕活性位点的靶向诱变将允许鉴定关键的 负责选择性金属结合的残基，最终揭示了组装和 激活继续。 为了全面了解活性部位发生的过程， Mn/Fe辅因子的性质将被表征以确定电子的热力学和动力学。 转移，有效催化的必要组成部分。最后，Mn/Fe蛋白的反应性范围将是 利用蛋白质工程技术进行扩展。 合理的金属蛋白质设计将与定向 进化方法产生能够选择性氧化靶底物的高活性酶。 总的来说，拟议的研究计划将填补有关Mn/Fe蛋白的许多现有知识空白， 更好地解决这些独特的辅因子可能在金属生物化学中发挥的生理作用， 微生物

Project Summary/Abstract    This  research  program  will  establish  the  fundamental  chemical  principles  underlying  the  newly  discovered  Mn/Fe  proteins.  The  active  sites  of  these  proteins  defy  conventional  inorganic  wisdom  to  spontaneously  assemble  a  bimetallic  cofactor  that  contains  two  different  transition  metals  in  nearly  identical  coordination  environments.  Following  assembly,  oxygen  is  activated  across  the  metal  centers  to  induce  a  one-­  or  two-­ electron  oxidation  reaction,  with  regeneration  occurring  via  intermolecular  electron  transfer.  Unlike  the  well-­ studied  diiron  enzyme  homologs,  the  molecular-­level  details  of  these  processes  in  Mn/Fe  proteins  remain  unknown.  Because  Mn/Fe-­containing  proteins  have  been  identified  primarily  in  extremophilic  and  pathogenic  organisms,  including  many  species  of  Chlamydia  and  Mycobacteria,  it  has  been  suggested  that  the  heterobimetallic  cofactor  may  offer  resistance  against  reactive  nitrogen  and/or  oxygen  species  generated  by  the host immune system. The proposed studies will probe this hypothesis using the R2lox proteins as a model  scaffold,  examining  reactivity  of  the  Mn/Fe  cofactor  relative  to  a  diiron  site.  Initial  studies  by  the  PI  have  indicated  aerobic  assembly  of  R2lox  proceeds  through  two  distinct  intermediates,  identified  by  time-­resolved  optical  and  EPR  spectroscopy.  The  proposed  work  will  use  an  array  of  spectroscopic  techniques,  including  optical,  resonance  Raman,  CW-­  and  pulsed  EPR,  and  Mössbauer,  to  elucidate  the  electronic  and  geometric  structures  of  these  intermediates.  Targeted  mutagenesis  around  the  active  site  will  allow  identification  of  key  residues  responsible  for  selective  metal  binding,  ultimately  revealing  the  mechanism  by  which  assembly  and  activation  proceed.  To  gain  a  comprehensive  picture  of  the  processes  occurring  at  the  active  site,  the  redox  properties  of  Mn/Fe  cofactors  will  be  characterized  to  determine  the  thermodynamics  and  kinetics  of  electron  transfer, a necessary component for efficient catalysis. Finally, the scope of reactivity of Mn/Fe proteins will be  expanded  using  protein  engineering  techniques.  Rational  metalloprotein  design  will  be  coupled  with  directed  evolution approaches to generate highly active enzymes capable of selective oxidation of targeted substrates.  Collectively,  the  proposed  research  program  will  fill  many  existing  knowledge  gaps  about  the  Mn/Fe  proteins,  better  resolving  the  physiological  role  that  these  unique  cofactors  may  play  in  the  metallobiochemistry  of  microbes.