抗泛素修饰长效Survivin显性负突变体的构建表达及其肿瘤细胞杀伤作用研究

在本申请基金的资助下，我课题组围绕促肿瘤增殖和抗凋亡的IAP家族分子Survivin的降解通路进行了研究，并希望从中发现触发Survivin降解的泛素化修饰位点，进而建立更有效的Survivin显性负突变策略，为肿瘤生物治疗奠定实验基础。我们顺利完成了第一年的年度计划，将所有Survivin赖氨酸（K）位点突变为丙氨酸（A），但是在第二年确认哪些K位点可能是受泛素分子（Ubiquitin）修饰的研究中，去没有发现不同K位点对Ubiquitin修饰存在差别。因此，我们在第二年的计划修改中，也申请就Survivin降解研究的方向从研究Survivin分子的蛋白质降解改为研究Survivin分子的转录后基因表达调节，即microRNA介导Survivin的负向表达调控。我们在喉癌细胞中发现：miR-203分子可以通过靶向降解survivin分子的mRNA，进而抑制肿瘤细胞的增殖能力，针对survivin分子的功能缺失及恢复实验进一步明确了两者之间的功能联系。同时，我们在喉癌样品中也确认miR-203与survivin的表达呈现反相关关系，这对解释miR203分子的抑癌功能和survivin分子在肿瘤细胞中的高表达提供了重要的理论证据。在对结肠癌中survivin表达调节的研究中，我们发现miR-320可以通过靶向抑制经典Wnt信号通路的关键共转录分子β-catenin下调survivin的表达，而在新鲜结肠癌标本的分析也确认miR-320与survivin的表达呈现反相关关系。为了更加系统和全面地分析miRNA分子对survivin的转录后基因沉默机制，我们克隆了survivin分子3’UTR全长2081bp的DNA片段，现在正在利用自行构建的包含350个miRNA前体分子的质粒系统进行报告基因筛查实验，进一步全面分析调控survivin的miRNA分子及其与肿瘤进程之间的关系。此外，在进行survivin显性负突变的研究过程中，我们利用成熟的蛋白质表达纯化平台也获得了一个N端融合TAT膜转位肽的FHIT抑癌融合蛋白，并在肝癌细胞中证明其可以通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡，提示其可能作为有效的肿瘤凋亡诱导分子。