Scission of DNA at a preselected sequence using a single-strand-specific chemical nuclease.
Scission of DNA at a preselected sequence using a single-strand-specific chemical nuclease.
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使用单链特异性化学核酸酶在预选序列上切割 DNA。
DOI：
10.1016/s1074-5521(98)90621-4
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发表时间：
1998
影响因子：
--
通讯作者：
Sigman,DS
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen,CH;Landgraf,R;Walts,AD;Chan,L;Schlonk,PM;Terwilliger,TC;Sigman,DS
背景：我们有兴趣开发一种专门切割大 DNA 的方案。之前开发此类方法的尝试因高水平的非特异性背景断裂而失败。 结果：选择 R 环形成用于序列特异性靶向，这是一种杂交方法，其中 RNA 使用 Watson-Crick 碱基配对在 70% 甲酰胺中置换相同序列的 DNA 链，从而形成三链结构。通过用化学试剂修饰碱基，R 环在水溶液中得以稳定。使用从单链特异性 M-13 基因 V 蛋白 (GVP) 的 Thr48→Cys 突变体制备的新型核酸酶切割 R 环，该核酸酶被 5-(碘乙酰氨基-β-丙氨酰)1,10-菲咯啉烷基化。将pGEM质粒的切割产物克隆至pCR 2.1-TOPO载体中。腺病毒 2 DNA（35.8 kb；比 pGEM 质粒大十倍）也在预选序列处进行定量切割。结论：开发了一种在任何预选序列处切割双链 DNA 的新方法。该切割方法依赖于 M-13 GVP 化学转化为核酸酶，反映了 GVP 对单链 DNA 的特异性。 GVP 嵌合体是半合成二级结构特异性核酸酶的第一个例子。 1,10-菲咯啉铜的化学核酸酶活性特别适合该技术，因为它氧化脱氧核糖部分而不产生可扩散的中间体，从而提供可克隆的 DNA 片段。该方案可用于生成大 DNA 片段，用于绘制探针的连续性或定义转录单元的外显子-内含子结构。
Background:We were interested in developing a protocol for cleaving large DNAs specifically. Previous attempts to develop such methods have failed to work because of high levels of nonspecific background scission.Results:R-loop formation was chosen for sequence-specific targeting, a method of hybridization whereby an RNA displaces a DNA strand of identical sequence in 70% formamide using Watson-Crick base-pairing, leading to a three-stranded structure. R-loops are stabilized in aqueous solution by modifying the bases with chemical reagents. The R-loop was cleaved using a novel nuclease prepared from the Thr48→Cys mutant of the single-strand-specific M-13 gene V protein (GVP), which was alkylated with 5-(iodoacetamido-β-alanyl)1,10-phenanthroline. The cleavage products of the pGEM plasmid were cloned into the pCR 2.1-TOPO vector. Adenovirus 2 DNA (35.8 kb; tenfold larger than the pGEM plasmid) was also cleaved quantitatively at a preselected sequence.Conclusions:A new method for cleaving duplex DNA at any preselected sequence was developed. The cleavage method relies on the chemical conversion of M-13 GVP into a nuclease, reflecting GVP's specificity for single-stranded DNA. The GVP chimera is the first example of a semisynthetic secondary structure specific nuclease. The chemical nuclease activity of 1,10-phenanthroline-copper is uniquely suited to this technique because it oxidizes the deoxyribose moiety without generating diffusible intermediates, providing clonable DNA fragments. The protocol could be useful in generating large DNA fragments for mapping the contiguity of probes or defining the exon-intron structure of transcription units.
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DOI：
10.1126/science.3296194
发表时间：
1987
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Smith,CL;Econome,JG;Schutt,A;Klco,S;Cantor,CR
通讯作者：
Cantor,CR
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影响因子：
14.9
作者：
Landgraf,R;Chen,CH;Sigman,DS
通讯作者：
Sigman,DS
影响因子：
64.8
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SIGMAN, DS;CHEN, CB;GORIN, MB
通讯作者：
GORIN, MB
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T. Rabbitts
通讯作者：
T. Rabbitts
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DOI：
10.1073/pnas.91.5.1721
发表时间：
1994
影响因子：
11.1
作者：
Pan,CQ;Feng,JA;Finkel,SE;Landgraf,R;Sigman,D;Johnson,RC
通讯作者：
Johnson,RC