Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.
Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.
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DOI：
10.1038/nprot.2014.173
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发表时间：
2014-11
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影响因子：
14.8
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中科院分区：
文献类型：
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作者：
真核生物膜蛋白的结构、生物化学和生物物理学研究常常受到候选分子过表达困难的阻碍。哺乳动物细胞的杆状病毒转导（BacMam）虽然是异源表达膜蛋白的有力方法，但对于筛选和表达多个构建体可能是麻烦的。因此，我们开发了质粒Eric Gouaux（pEG）BacMam，这是一种优化的载体，用于筛选测定，以及用于杆状病毒的有效生产和靶蛋白的稳健表达。在该方案中，我们展示了如何使用小规模瞬时转染和荧光检测，尺寸排阻色谱（FSEC）实验，使用GFP-His 8标记的候选蛋白筛选单分散性和表达水平。一旦有希望的候选人被确定，我们描述了如何产生杆状病毒，ENUHEK 293 S GnTI−（N-乙酰葡糖胺转移酶I阴性）细胞悬浮培养，并过表达候选蛋白。我们已经使用这些方法制备了鸡酸敏感离子通道1a（cASIC 1）和秀丽隐杆线虫谷氨酸门控氯离子通道（GluCl）的纯样品，用于X射线晶体学，展示了如何快速有效地筛选数百种构建体并在4-6周内完成大规模表达。
Structural, biochemical and biophysical studies of eukaryotic membrane proteins are often hampered by difficulties in over-expression of the candidate molecule. Baculovirus transduction of mammalian cells (BacMam), although a powerful method to heterologously express membrane proteins, can be cumbersome for screening and expression of multiple constructs. We therefore developed plasmid Eric Gouaux (pEG) BacMam, a vector optimized for use in screening assays, as well as for efficient production of baculovirus and robust expression of the target protein. In this protocol we show how to use small-scale transient transfection and fluorescence-detection, size-exclusion chromatography (FSEC) experiments using a GFP-His8 tagged candidate protein to screen for monodispersity and expression level. Once promising candidates are identified, we describe how to generate baculovirus, transduce HEK293S GnTI− (N-acetylglucosaminyltransferase I-negative) cells in suspension culture, and over-express the candidate protein. We have used these methods to prepare pure samples of chicken acid-sensing ion channel 1a (cASIC1) and Caenorhabditis elegans glutamate-gated chloride channel (GluCl), for X-ray crystallography, demonstrating how to rapidly and efficiently screen hundreds of constructs and accomplish large-scale expression in 4-6 weeks.
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