Steady-state acceptor fluorescence anisotropy imaging under evanescent excitation for visualisation of FRET at the plasma membrane.
Steady-state acceptor fluorescence anisotropy imaging under evanescent excitation for visualisation of FRET at the plasma membrane.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0110695
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发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Ameer-Beg SM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Devauges V;Matthews DR;Aluko J;Nedbal J;Levitt JA;Poland SP;Coban O;Weitsman G;Monypenny J;Ng T;Ameer-Beg SM
我们提出了一种新的成像系统，结合了全内反射荧光（TIRF）显微镜和稳态受体荧光各向异性的测量，以便在质膜上进行活细胞Förster共振能量转移（FRET）成像。我们直接比较了荧光各向异性分辨TIRF与会聚荧光照明的成像性能。高数值孔径物镜在红外射频成像中的应用需要对诱发去极化因素进行校正。通过测量eGFP和mRFP1之间的分子内FRET，这种排列能够可视化Raichu-Cdc42 FRET生物传感器的构象变化。与细胞内探针相比，在细胞膜上发现了更高的活性。红外射频成像荧光各向异性使Raichu-Cdc42生物传感器与阴性对照突变体明显分化。最后，在活细胞中动态成像Cdc42的抑制作用，我们显示了Raichu-Cdc42生物传感器活性的时间变化。
We present a novel imaging system combining total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with measurement of steady-state acceptor fluorescence anisotropy in order to perform live cell Förster Resonance Energy Transfer (FRET) imaging at the plasma membrane. We compare directly the imaging performance of fluorescence anisotropy resolved TIRF with epifluorescence illumination. The use of high numerical aperture objective for TIRF required correction for induced depolarization factors. This arrangement enabled visualisation of conformational changes of a Raichu-Cdc42 FRET biosensor by measurement of intramolecular FRET between eGFP and mRFP1. Higher activity of the probe was found at the cell plasma membrane compared to intracellularly. Imaging fluorescence anisotropy in TIRF allowed clear differentiation of the Raichu-Cdc42 biosensor from negative control mutants. Finally, inhibition of Cdc42 was imaged dynamically in live cells, where we show temporal changes of the activity of the Raichu-Cdc42 biosensor.
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DOI：
10.1093/jnci/53.3.661
发表时间：
1974-01-01
期刊：
JOURNAL OF THE NATIONAL CANCER INSTITUTE
影响因子：
--
作者：
CAILLEAU, R;YOUNG, R;REEVES, WJ
通讯作者：
REEVES, WJ
影响因子：
4.4
作者：
BERBERANSANTOS, MN;VALEUR, B
通讯作者：
VALEUR, B
DOI：
10.1007/s00249-008-0361-5
发表时间：
2008-11-01
影响因子：
2
作者：
Beutler, Martin;Makrogianneli, Konstantina;Heintzmann, Rainer
通讯作者：
Heintzmann, Rainer
涂有网状蛋白涂层坑的前五秒钟。
影响因子：
64.5
作者：
Cocucci E;Aguet F;Boulant S;Kirchhausen T
通讯作者：
Kirchhausen T
影响因子：
7.4
作者：
BALLEW, RM;DEMAS, JN
通讯作者：
DEMAS, JN