The RNA polymerase activity of SARS-coronavirus nsp12 is primer dependent.
The RNA polymerase activity of SARS-coronavirus nsp12 is primer dependent.
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DOI：
10.1093/nar/gkp904
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发表时间：
2010-01
影响因子：
14.9
通讯作者：
Snijder EJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
te Velthuis AJ;Arnold JJ;Cameron CE;van den Worm SH;Snijder EJ
RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）是所有正链RNA病毒的RNA合成机制的中心催化亚基。通常，RdRp结构域很容易通过比较序列分析来识别，但生物化学确认和表征可能会受到内在蛋白质特性和技术复杂性的阻碍。SARS冠状病毒（SARS-CoV）RNA基因组的复制和转录可能是由非结构蛋白12（nsp 12）C端的RdRp结构域催化的。然而，迄今为止，全长nsp 12已被证明在细菌系统中难以表达，这阻碍了冠状病毒RNA合成的生化表征和RdRp靶向抗病毒药物设计。在这里，我们描述了一种组合策略，涉及细菌表达的nsp 12融合蛋白及其在体内裂解，以产生和纯化稳定的SARS冠状病毒nsp 12（106 kDa）与天然的N-末端和C-末端六组氨酸标签。这种重组蛋白具有强大的体外RdRp活性，以及显着的DNA依赖性活性，可能有助于未来的抑制剂研究。SARS-CoV nsp 12是依赖于同源和异源聚合物模板的引物，支持与最近提出的冠状病毒nsp 8的有趣的RNA引发酶活性密切的酶合作。
An RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) is the central catalytic subunit of the RNA-synthesizing machinery of all positive-strand RNA viruses. Usually, RdRp domains are readily identifiable by comparative sequence analysis, but biochemical confirmation and characterization can be hampered by intrinsic protein properties and technical complications. It is presumed that replication and transcription of the ∼30-kb severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus (SARS-CoV) RNA genome are catalyzed by an RdRp domain in the C-terminal part of nonstructural protein 12 (nsp12), one of 16 replicase subunits. However, thus far full-length nsp12 has proven refractory to expression in bacterial systems, which has hindered both the biochemical characterization of coronavirus RNA synthesis and RdRp-targeted antiviral drug design. Here, we describe a combined strategy involving bacterial expression of an nsp12 fusion protein and its in vivo cleavage to generate and purify stable SARS-CoV nsp12 (106 kDa) with a natural N-terminus and C-terminal hexahistidine tag. This recombinant protein possesses robust in vitro RdRp activity, as well as a significant DNA-dependent activity that may facilitate future inhibitor studies. The SARS-CoV nsp12 is primer dependent on both homo- and heteropolymeric templates, supporting the likeliness of a close enzymatic collaboration with the intriguing RNA primase activity that was recently proposed for coronavirus nsp8.
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DOI：
10.1038/nrmicro975
发表时间：
2004-09
期刊：
Nature reviews. Microbiology
影响因子：
--
作者：
De Clercq E
通讯作者：
De Clercq E
影响因子：
4.8
作者：
Beckman, MTL;Kirkegaard, K
通讯作者：
Kirkegaard, K
影响因子：
5
作者：
Imbert I;Snijder EJ;Dimitrova M;Guillemot JC;Lécine P;Canard B
通讯作者：
Canard B
影响因子：
5
作者：
Gorbalenya AE;Enjuanes L;Ziebuhr J;Snijder EJ
通讯作者：
Snijder EJ
影响因子：
3.7
作者：
Cheng A;Zhang W;Xie Y;Jiang W;Arnold E;Sarafianos SG;Ding J
通讯作者：
Ding J