Quantitation of supercoiled DNA cleavage in nonradioactive DNA: application to ionizing radiation and synthetic endonuclease cleavage.
Quantitation of supercoiled DNA cleavage in nonradioactive DNA: application to ionizing radiation and synthetic endonuclease cleavage.
复制标题
非放射性 DNA 中超螺旋 DNA 裂解的定量：在电离辐射和合成核酸内切酶裂解中的应用。
DOI：
10.1016/0003-2697(92)90176-8
复制
发表时间：
1992
影响因子：
2.9
通讯作者：
Sutherland,JC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sutherland,BM;Bennett,PV;Conlon,K;Epling,GA;Sutherland,JC
在乙锭染色的电泳凝胶上，非放射性超螺旋DNA向其开环或线性形式的转化的定量一直很困难，因为在不同条件下乙锭与超螺旋DNA的结合与其他形式的结合不同，以及照相胶片的非线性响应。我们已经开发了用于添加线性DNA作为内部荧光标准以“标准化”加载到凝胶的每个泳道中的DNA的量的方法。在用于单个超螺旋切割反应的分区之前在样品中包含线性归一化DNA允许对所得物质进行定量，在技术上是容易的，并且不需要将样品定量应用于凝胶。如果在超螺旋切割过程中不希望存在标准化DNA，则在超螺旋切割后（但在电泳前）向每个样品中加入标准化质粒或将仅含有测试DNA的样品定量应用于凝胶得到类似的数据，但具有增加的可变性。我们使用标准化DNA的方法在裂解的物理剂（电离辐射），并在一个更复杂的情况下，由蛋白质为基础的，光依赖性的合成核酸内切酶。我们展示了如何完整的超螺旋DNA的分数可以计算从测量的切割和归一化的物种。该方法也可用于涉及耗尽一种DNA种类的反应，无论是否超螺旋，例如通过凝胶阻滞测定检测的蛋白质-DNA相互作用。
Quantitation of the conversion of nonradioactive supercoiled DNA to its open circular or linear forms on ethidium-stained electrophoretic gels has been difficult because of differential binding of ethidium to supercoiled DNA vs other forms under different conditions and the nonlinear response of photographic film. We have developed methods for adding a linear DNA as an internal fluorescence standard to “normalize” the quantity of DNA loaded into each lane of a gel. Inclusion of a linear normalizing DNA in samples before partitioning for individual supercoil cleavage reactions allows the quantitation of the resultant species, is technically easy, and does not require quantitative application of the sample to the gel. If the presence of a normalizing DNA during supercoil cleavage is undesirable, the addition of a normalizing plasmid to each sample after supercoil cleavage (but before electrophoresis) or the quantitative application of samples containing test DNA alone to the gel gives similar data, but with increased variability. We use the normalizing DNA method in cleavage by a physical agent (ionizing radiation) and in a more complex situation, by a protein-based, light-dependent synthetic endonuclease. We show how the fraction of intact supercoiled DNA can be calculated from measurement of the cleaved and normalizing species only. The method also can be used in reactions involving the depletion of one DNA species, whether supercoiled or not, such as protein-DNA interactions as detected by gel retardation assays.
登录
查看更多内容
凝胶电泳中 DNA 的照相定量。
影响因子：
2.9
作者：
A. Prunell;F. Strauss;B. Leblanc
通讯作者：
B. Leblanc
来自大肠杆菌的 40,000 道尔顿 DNA 光复活酶的底物范围。
影响因子：
2.9
作者：
Sutherland,BM;Oliveira,OM;Ciarrocchi,G;Brash,DE;Haseltine,WA;Lewis,RJ;Hanawalt,PC
通讯作者：
Hanawalt,PC
影响因子：
2.9
作者：
John C. Sutherland;Bohai Lin;D. Monteleone;JoAnn H. Mugavero;B. M. Sutherland;J. Trunk
通讯作者：
John C. Sutherland;Bohai Lin;D. Monteleone;JoAnn H. Mugavero;B. M. Sutherland;J. Trunk
高强度紫外线照射 DNA 中单链和双链断裂的形成
影响因子：
3.3
作者：
T. Masnyk;K. Minton
通讯作者：
K. Minton
琼脂糖凝胶上插入 DNA 的溴化乙锭的定量荧光。
影响因子：
2.9
作者：
E. Ribeiro;L. Larcom;D. Miller
通讯作者：
D. Miller