A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C.
A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C.
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DOI：
10.1083/jcb.200302125
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发表时间：
2003-06-09
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Newton AC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Violin JD;Zhang J;Tsien RY;Newton AC
激酶转导的信号取决于底物磷酸化的程度和持续时间。我们生成了PKC活性的遗传编码荧光报告，可对激活PKC的刺激作出可逆反应。具体来说，在哺乳动物细胞中表达的报告蛋白磷酸化会引起荧光共振能量转移（FRET）的变化，从而可以实时成像PKC激活引起的磷酸化。将报告蛋白靶向到PKC被激活的质膜，揭示了HeLa细胞对组胺的振荡磷酸化反应。底物磷酸化的每次振荡都伴随着一个钙振荡，其滞后时间为10 s。新的基于fret的PKC易位、磷酸肌苷二磷酸转化为IP3和二酰基甘油的报告显示，在HeLa细胞中，振荡磷酸化与Ca2+控制的常规PKC向膜的易位相关，而没有PLC活性或二酰基甘油的振荡。然而，在ATP刺激的MDCK细胞中，PLC和二酰基甘油随Ca2+和磷酸化一起波动。因此，PKC信号的特异性取决于局部第二信使控制的激酶和磷酸酶活性之间的平衡，从而导致底物磷酸化的严格钙控制的时间调节。
Signals transduced by kinases depend on the extent and duration of substrate phosphorylation. We generated genetically encoded fluorescent reporters for PKC activity that reversibly respond to stimuli activating PKC. Specifically, phosphorylation of the reporter expressed in mammalian cells causes changes in fluorescence resonance energy transfer (FRET), allowing real time imaging of phosphorylation resulting from PKC activation. Targeting of the reporter to the plasma membrane, where PKC is activated, reveals oscillatory phosphorylation in HeLa cells in response to histamine. Each oscillation in substrate phosphorylation follows a calcium oscillation with a lag of ∼10 s. Novel FRET-based reporters for PKC translocation, phosphoinositide bisphosphate conversion to IP3, and diacylglycerol show that in HeLa cells the oscillatory phosphorylations correlate with Ca2+-controlled translocation of conventional PKC to the membrane without oscillations of PLC activity or diacylglycerol. However, in MDCK cells stimulated with ATP, PLC and diacylglycerol fluctuate together with Ca2+ and phosphorylation. Thus, specificity of PKC signaling depends on the local second messenger-controlled equilibrium between kinase and phosphatase activities to result in strict calcium-controlled temporal regulation of substrate phosphorylation.
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