Simplified, enhanced protein purification using an inducible, autoprocessing enzyme tag.
Simplified, enhanced protein purification using an inducible, autoprocessing enzyme tag.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0008119
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发表时间：
2009-12-02
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Bogyo M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Shen A;Lupardus PJ;Morell M;Ponder EL;Sadaghiani AM;Garcia KC;Bogyo M
我们介绍了一种新的方法来纯化在细菌中表达的重组蛋白，该方法使用了一个高度特异的、可诱导的、自切割的蛋白酶标签。该标签由霍乱弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)组成，这是一种自动处理酶，在目标蛋白-CPD连接处的亮氨酸残基后专门切割。重要的是，霍乱弧菌CPD是由六磷酸肌醇(InsP6)特异性激活的，InsP6是一种真核特异性小分子，不存在于细菌胞浆中。因此，将His6标记的CPD融合到目的蛋白的C末端并在大肠杆菌中表达，可以用金属离子亲和层析从细菌裂解物中纯化出全长融合蛋白。随后将InsP6加入到固定化的融合蛋白中，在目标蛋白-CPD连接处诱导CPD介导的切割，将未标记的目标蛋白释放到上清液中。该方法将亲和层析和融合标签切割浓缩为一步，省去了外源蛋白酶去除融合标签的需要(S)，提高了标签分离的效率。此外，除了省时、通用和廉价外，我们的结果表明，CPD纯化系统可以提高来自不同生物体的难处理蛋白质的表达、完整性和溶解性。
We introduce a new method for purifying recombinant proteins expressed in bacteria using a highly specific, inducible, self-cleaving protease tag. This tag is comprised of the Vibrio cholerae MARTX toxin cysteine protease domain (CPD), an autoprocessing enzyme that cleaves exclusively after a leucine residue within the target protein-CPD junction. Importantly, V. cholerae CPD is specifically activated by inositol hexakisphosphate (InsP6), a eukaryotic-specific small molecule that is absent from the bacterial cytosol. As a result, when His6-tagged CPD is fused to the C-terminus of target proteins and expressed in Escherichia coli, the full-length fusion protein can be purified from bacterial lysates using metal ion affinity chromatography. Subsequent addition of InsP6 to the immobilized fusion protein induces CPD-mediated cleavage at the target protein-CPD junction, releasing untagged target protein into the supernatant. This method condenses affinity chromatography and fusion tag cleavage into a single step, obviating the need for exogenous protease addition to remove the fusion tag(s) and increasing the efficiency of tag separation. Furthermore, in addition to being timesaving, versatile, and inexpensive, our results indicate that the CPD purification system can enhance the expression, integrity, and solubility of intractable proteins from diverse organisms.
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影响因子：
64.5
作者：
Park CY;Hoover PJ;Mullins FM;Bachhawat P;Covington ED;Raunser S;Walz T;Garcia KC;Dolmetsch RE;Lewis RS
通讯作者：
Lewis RS
影响因子：
16
作者：
Skiniotis, Georgios;Lupardus, Patrick J.;Martick, Monika;Walz, Thomas;Garcia, K. Christopher
通讯作者：
Garcia, K. Christopher
影响因子：
11.4
作者：
Sheahan, Kerri-Lynn;Cordero, Christina L.;Satchell, Karla J. Fullner
通讯作者：
Satchell, Karla J. Fullner
DOI：
10.1126/science.1162403
发表时间：
2008-10-10
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Lupardus PJ;Shen A;Bogyo M;Garcia KC
通讯作者：
Garcia KC
影响因子：
3.8
作者：
Raboy, V
通讯作者：
Raboy, V