High-throughput mutate-map-rescue evaluates SHAPE-directed RNA structure and uncovers excited states.
High-throughput mutate-map-rescue evaluates SHAPE-directed RNA structure and uncovers excited states.
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高通量 mutate-map-rescue 评估 SHAPE 导向的 RNA 结构并揭示激发态。
DOI：
10.1261/rna.044321.114
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发表时间：
2014-11
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Das R
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Tian S;Cordero P;Kladwang W;Das R
非编码RNA的三维构象支持其生化功能，但在很大程度上回避了实验表征。在这里，我们报告说，将经典的突变/拯救策略与高通量化学作图相结合，可以快速推断RNA结构，并具有非常强的验证能力。我们重新审视了一个16 S rRNA结构域，其中SHAPE（选择性2′-羟基酰化引物延伸）和有限的突变分析表明了载脂蛋白和全核糖体构象之间的构象变化。计算支持估计，来自替代化学探针的数据，以及突变和映射（M2）实验突出了先前方法的问题，而是给出了近晶体学的二级结构。通过高通量突变/拯救方法系统地询问单个碱基对，然后允许对基于M2的二级结构进行深入验证和细化。这些数据进一步揭示了功能构象作为通过单核苷酸寄存器移位可访问的激发态（20 ± 10%群体）。这些结果纠正了错误的核糖体构象变化的形状推断，暴露了传统的结构映射方法的关键限制，并说明了更尖锐的解剖RNA动态结构景观的实际步骤。
The three-dimensional conformations of noncoding RNAs underpin their biochemical functions but have largely eluded experimental characterization. Here, we report that integrating a classic mutation/rescue strategy with high-throughput chemical mapping enables rapid RNA structure inference with unusually strong validation. We revisit a 16S rRNA domain for which SHAPE (selective 2′-hydroxyl acylation with primer extension) and limited mutational analysis suggested a conformational change between apo- and holo-ribosome conformations. Computational support estimates, data from alternative chemical probes, and mutate-and-map (M2) experiments highlight issues of prior methodology and instead give a near-crystallographic secondary structure. Systematic interrogation of single base pairs via a high-throughput mutation/rescue approach then permits incisive validation and refinement of the M2-based secondary structure. The data further uncover the functional conformation as an excited state (20 ± 10% population) accessible via a single-nucleotide register shift. These results correct an erroneous SHAPE inference of a ribosomal conformational change, expose critical limitations of conventional structure mapping methods, and illustrate practical steps for more incisively dissecting RNA dynamic structure landscapes.
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DOI：
10.1093/bioinformatics/btp250
发表时间：
2009-08-01
期刊：
Bioinformatics (Oxford, England)
影响因子：
--
作者：
Darty K;Denise A;Ponty Y
通讯作者：
Ponty Y
影响因子：
21.8
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
4.1
作者：
Grover, Richa;Sharathchandra, Arandkar;Das, Saumitra
通讯作者：
Das, Saumitra
影响因子：
2.9
作者：
Kladwang W;Mann TH;Becka A;Tian S;Kim H;Yoon S;Das R
通讯作者：
Das R
影响因子：
2.9
作者：
Kladwang, Wipapat;Das, Rhiju
通讯作者：
Das, Rhiju