Lumineszente ATP-sensitive Sonden für die Aktivitätsbestimmung von Enzymen

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Ziel des Projekts ist die Entwicklung und Erprobung einer neuen Methode zur fluoreszenten Detektion verschiedener enzymatischer Phosphorylierungsreaktionen, die in der pharmazeutischen Wirkstoffforschung und in der klinischen Chemie eine wichtige Rolle spielen. Dies beinhaltet beispielsweise das Screening nach Regulatoren für die Kinase-, Phosphatase- bzw. Phosphodiesteraseaktivität, oder Testmethoden, um die Aktivierung der cAMP-Synthese (cyclisches Adenosinmonophosphat) zu untersuchen. All diese Tests werden beim ¿High-Throughput Screening (HTS) in der Mikrotiterplatte mittels aufwändiger immunodiagnostischer oder enzymatischer Verfahren durchgeführt, die entweder einen spezifischen Antikörper gegen einen der gebildeten Produkte enthalten (z.B. anti-cAMP) oder diese in gekoppelten enzymatischen Reaktionen nachweisen.Im Rahmen dieses Projekts sollen Fluoreszenz-Assays entwickelt und optimiert werden, die den Umsatz von ATP unter Bildung von ADP bzw. cAMP direkt ohne Zugabe von Antikörpern (oder gekoppelter enzymatischer Indikatorreaktionen) anzeigen und damit die Bestimmung der Aktivitäten der an diesen Umsetzungen beteiligten Enzyme (bzw. die Untersuchung deren Hemmung oder Aktivierung) ermöglichen. Als Indikator dient dabei ein Europium-Tetracyclin-Komplex [Eu(Tc)], dessen freie Koordinationsstellen reversibel von zusätzlichen Liganden, wie z.B. Phosphatgruppen, abgesättigt werden können. Dabei treten sowohl spezifische Änderungen in der Lumineszenzintensität I als auch in der Lumineszenzlebensdauer ¿ auf.Die Anwendbarkeit dieser einfachen und im Gegensatz zu den immunodiagnostischen oder enzymatischen Tests stark verbilligten Methode soll für verschiedene analytisch relevante Fragestellungen untersucht werden. Schließlich soll für die aussichtsreichsten Anwendungsmöglichkeiten (Screening von Agonisten/ Antagonisten, medizinische Diagnostik, Lebensmittelanalytik) ein optimierter zeitaufgelöster Fluoreszenztest für das HTS erarbeitet und standardisiert werden. Dazu wird ein einfaches und preiswertes Imaging-System für Mikrotiterplatten (MTP) aufgebaut, welches speziell für das Fluorezenz-Lifetime-Imaging des Europium-Tetracyclin-Komplexes geeignet ist.