Charakterisierung und Modifikation der Substratspezifität clostridieller Neurotoxine

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Clostridielle Neurotoxine unterbinden die Neurotransmitterfreisetzung von Nervenzellen, indem ihre katalytischen Domänen (LC) die an der neuronalen Exozytose beteiligten SNAREs spalten. Die Botulinusneurotoxine (BoNT) A, C und E proteolysieren SNAP-25, während VAMP/Synaptobrevin-2 das Substrat von BoNT/B, D, F, G und Tetanusneurotoxin (TeNT) ist. BoNT/C spaltet zusätzlich Syntaxin-1. Von allen drei Substraten existieren Isoformen, die andere Membranfusionsprozesse im intrazellulären Transportgeschehen katalysieren. Bis auf wenige Ausnahmen werden diese Isoformen nicht gespalten. In dem beantragten Projekt soll die molekulare Grundlage dieser Selektivität erarbeitet werden. Hierfür sollen die Substratbindungstaschen von LCA, B, D und TeNT identifiziert und durch Mutagenese charakterisiert werden. Basierend auf diesen Informationen und vorliegenden Kristallstrukturdaten sollen dann entscheidende Substratbindungstaschen derart verändert werden, dass die katalytische Aktivität dieser LCs auf SNAP-23 bzw. TI-VAMP/VAMP-7 erweitert bzw. umgelenkt wird. Dies soll durch gezielte Mutagenese erreicht werden. Für LCA und LCF sollen ergänzend auch ausgewählte Bindungstaschen durch saturierende Zufallsmutagenese mutiert und SNAP-23 bzw. TI-VAMP effizient spaltende LC-Mutanten mit einem hefegestützten Selektionsverfahren identifiziert werden.