Funktionelle Bedeutung der tandemartigen Anordnung der SNARE-Motive in SNAP-25 im Kontext der schnellen, Ca2+-abhängigen Exozytose

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Das an der Exozytose beteiligte SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor)-Protein SNAP-25 weist durch eine tandemartige Verknüpfung von zwei SNARE-Motiven ein strukturelles Merkmal auf, das funktionell wenig verstanden ist. Evolutionär scheint aus zwei getrennten membranverankerten SNARE-Proteinen mit einzelnen SNARE-Motiven ein membranassoziiertes Protein gebildet worden zu sein, in dem die beiden Motive über einen mit Palmitoylierungsstellen ausgestatteten „Linker“ verknüpft sind. Im hier vorgeschlagenen Projekt sollen die mechanistischen Gründe dieser Anpassung im Kontext der schnellen, regulierten Exozytose analysiert werden. Dazu sollen verschiedene Charakteristika der „Linker“-Struktur manipuliert, und die funktionellen Konsequenzen für die Vesikelfusion untersucht werden. „Linker“-Länge, Integrität, sowie die relative Position der Palmitoylierungsstellen und der Palmitoylierungsgrad sollen als potentielle Einflußgrößen auf die Sekretionsfähigkeit untersucht werden. Mutierte SNAP-25-Varianten sollen hierbei in Snap-25-/-- Chromaffinzellen mit Hilfe eines viralen Expressionssystems exprimiert werden, um die rekonstituierte Sekretion mittels zeitlich hochauflösender elektrophysiologischer Methoden auf Änderungen in den Freisetzungseigenschaften zu analysieren. Lokalisationseffekte aufgrund veränderter Palmitoylierungsmuster sollen anhand von Fluorophor-markierten SNAP-25-Fusionproteinen untersucht werden.