Biomedical application of fish collagen: Development of the bone-mimetic collagen-fibril coating on the titan-made bone implant

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(a) 骨ミメティック構造の創出：　2021年度に創出した方法を改良し，石灰化誘起溶液のCa・Pi濃度を再調整し，細胞培養ウェル底面に一様に石灰化したコラーゲン線維層をコーティングすることに成功した．X線回折（XRD）解析ではヒドロキシアパタイト（HA）結晶のピークが観察され，生体骨同様にHA結晶が沈着していることが証明された．ただし，そのCa/P比は約1.4で，HA結晶の理論値（1.67）より低く，HA以外の結晶体を少量含むと予想された．（b）チタン材料表面への骨ミメティックコート技術の開発：　Yabutsuka (2020)を参考として，チタン材料表面にHA結晶をコーティングした．その結果，アルカリSBFと正常SBFに順番に浸漬することで，結晶を成長させ得ることを示した．成長した結晶にはHAが含まれることが示唆されたが，Ca/P比は1.3程度と他の結晶成分が混在する可能性があり，HAの存在比を増加させる必要がある．なお，チタン材料表面にコーティングした結晶層にコラーゲン原線維をコーティングすることにも成功したが，線維の配向性が低かった．今後この点の改良が必要である．(c) 骨ミメティック構造に対する幹細胞反応性の解明：　まず原線維コーティング上にヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC，ロンザ株式会社）を培養し，骨芽細胞分化指標として頻用されるアルカリフォスファターゼ（ALP）活性とアリザリンレッド（AR）染色による石灰化物の検出を試みたところ，前者ではALP抽出時にコーティングしたコラーゲン層も抽出されるという問題が生じた．また，後者ではコラーゲン層が自発的に石灰化してAR陽性となることが示され，両者を用いた定法では骨芽細胞分化状態の把握ができなかった．現在，qPCRを用いた幹細胞の遺伝子発現プロファイルの解析技術開発を進めている．