Manipulation of G12/13 signaling and and drug development strategy

G12共役型デザイナーGPCR(G12D)を肝細胞特異的に発現させたHep-G12Dマウスの個体レベルの代謝変化について、代謝ケージを用いて酸素消費量と二酸化炭素排出量を測定した。デザイナーリガンドを1週間前処置したHep-G12Dマウスにおいて呼吸商が低下していたことから、エネルギー源として脂質が使われることがわかった。ミトコンドリア活性が上昇していることを想定し、デザイナーリガンドを投与したHep-G12Dマウスの肝臓からミトコンドリアを単離し、電子伝達系複合体の活性を測定した。その結果、複合体IVの活性上昇が確認された。さらに、肝臓のRNA-seq解析を行ったところ、酸化的リン酸化が有意に変動する経路として見出された。G12Dを脂肪細胞に特異的に発現させたAdipo-G12Dマウスについて、初代培養脂肪細胞のベージュ誘導系を試したところ、個体での表現型と同様に、デザイナーリガンド処置により脱分化因子Ucp1の発現上昇が見られた。シグナル阻害剤を試したところ、G12経路下流のROCK阻害剤でUcp1発現が抑制された。アセチルコリンM1受容体とGq複合体の構造情報から、M1骨格デザイナーGPCR(M1D-G12)とGタンパク質のC末端ヘリックスの複合体の分子動力学計算を行ったところ、G12とG13のC末端の結合様式に差異が見られた。Gタンパク質の点置換コンストラクトによる変異体解析により、G12とG13の選択性に関わるGタンパク質の残基を絞り込んだ。さらに、受容体側の変異体解析を行い、G12とG13の活性バランスが変化する変異体を見出した。GPCRの構造解析については、性状のよいFFAR2コンストラクトを構築することができ、Giとの安定的な複合体形成が観察された。

G12共役型デザイナーGPCR(G12D)を肝細胞特異的に発現させたHep-G12Dマウスの個体レベルの代謝変化について、代謝ケージを用いて酸素消費量と二酸化炭素排出量を測定した。デザイナーリガンドを1週間前処置したHep-G12Dマウスにおいて呼吸商が低下していたことから、エネルギー源として脂質が使われることがわかった。ミトコンドリア活性が上昇していることを想定し、デザイナーリガンドを投与したHep-G12Dマウスの肝臓からミトコンドリアを単離し、電子伝達系複合体の活性を測定した。その結果、複合体IVの活性上昇が確認された。さらに、肝臓のRNA-seq解析を行ったところ、酸化的リン酸化が有意に変動する経路として見出された。G12Dを脂肪細胞に特異的に発現させたAdipo-G12Dマウスについて、初代培養脂肪細胞のベージュ誘導系を試したところ、個体での表現型と同様に、デザイナーリガンド処置により脱分化因子Ucp1の発現上昇が見られた。シグナル阻害剤を試したところ、G12経路下流のROCK阻害剤でUcp1発現が抑制された。アセチルコリンM1受容体とGq複合体の構造情報から、M1骨格デザイナーGPCR(M1D-G12)とGタンパク質のC末端ヘリックスの複合体の分子動力学計算を行ったところ、G12とG13のC末端の結合様式に差異が見られた。Gタンパク質の点置換コンストラクトによる変異体解析により、G12とG13の選択性に関わるGタンパク質の残基を絞り込んだ。さらに、受容体側の変異体解析を行い、G12とG13の活性バランスが変化する変異体を見出した。GPCRの構造解析については、性状のよいFFAR2コンストラクトを構築することができ、Giとの安定的な複合体形成が観察された。