ショウジョウバエのRNAサイレンシング関連因子の構造機能解析

果蝇RNA沉默相关因子的结构和功能分析

• 批准号: 21J11067
• 负责人: 山口 そのみ
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J11067/
• 关键词: クライオ電子顕微鏡; RNAサイレンシング; 小分子RNA

ショウジョウバエのAgo2はシャペロン依存的な構造変化を起こし、二本鎖siRNAを受け取ることが知られている。今年度はシャペロンタンパク質であるHsp90、Hsp70、Hopを昆虫細胞であるSf9で発現させ大量精製に成功した。Hsp90、70の機能を補助するタンパク質であるp23、Droj2も大腸菌で発現と精製に成功した。また、FLAGタグを付加したAgo2を哺乳類細胞であるHEK293細胞で発現させ、その細胞破砕液とFLAG抗体付きビーズに混合した。その後、精製したHsp90、Hsp70、Hopを混合させ免疫沈降実験を行ったところ、Sf9から精製したシャペロンタンパク質はATP依存的にAgo2に結合することが明らかになった。またAgo2は単体ではFLAGレジンから溶出されないことが知られていたが、天然変性タンパク質であるheat-resistant obscure(HERO)を添加することで溶出に成功した。さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合体の再構成に成功した。

Ago2 gene expression is dependent on the structure of the gene, and the expression of the gene is dependent on the structure of the gene. This year, the quality of Hsp90, Hsp70 and Hop 9 insect cells was successfully refined. Hsp90, 70 function support, quality support, p23, Droj2, coliform development and purification success The FLAG antibody was added to the Ago2 mammalian cells and the HEK293 cells were mixed. Hsp90, Hsp70, Hop, Hsp90, Hsp90, Hsp Ago2 is a single substance. It is a natural substance. It is a heat-resistant obscure(HERO). It is dissolved successfully. In addition, FLAG requested to combine Ago2, Dicer-2-R2D2, refined siRNAs with mixed substances, Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA complex, FLAG requested to combine Ago2, Dicer-2-R2D2, refined siRNAs with mixed substances, and Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA complex was successfully reconstituted.

项目成果

Structure of a Dicer-2-R2D2-siRNA complex

Dicer-2-R2D2-siRNA 复合物的结构

• 发表时间: 2023
• 作者: 山口そのみ;永沼 政広;西澤知宏;草木迫司;泊幸秀;西増弘志;濡木理
• 通讯作者: 濡木理