ショウジョウバエのRNAサイレンシング関連因子の構造機能解析

ショウジョウバエのAgo2はシャペロン依存的な構造変化を起こし、二本鎖siRNAを受け取ることが知られている。今年度はシャペロンタンパク質であるHsp90、Hsp70、Hopを昆虫細胞であるSf9で発現させ大量精製に成功した。Hsp90、70の機能を補助するタンパク質であるp23、Droj2も大腸菌で発現と精製に成功した。また、FLAGタグを付加したAgo2を哺乳類細胞であるHEK293細胞で発現させ、その細胞破砕液とFLAG抗体付きビーズに混合した。その後、精製したHsp90、Hsp70、Hopを混合させ免疫沈降実験を行ったところ、Sf9から精製したシャペロンタンパク質はATP依存的にAgo2に結合することが明らかになった。またAgo2は単体ではFLAGレジンから溶出されないことが知られていたが、天然変性タンパク質であるheat-resistant obscure(HERO)を添加することで溶出に成功した。さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合体の再構成に成功した。

ショウジョウバエのAgo2はシャペロン依存的な構造変化を起こし、二本鎖siRNAを受け取ることが知られている。今年度はシャペロンタンパク質であるHsp90、Hsp70、Hopを昆虫細胞であるSf9で発現させ大量精製に成功した。Hsp90、70の機能を補助するタンパク質であるp23、Droj2も大腸菌で発現と精製に成功した。また、FLAGタグを付加したAgo2を哺乳類細胞であるHEK293細胞で発現させ、その細胞破砕液とFLAG抗体付きビーズに混合した。その後、精製したHsp90、Hsp70、Hopを混合させ免疫沈降実験を行ったところ、Sf9から精製したシャペロンタンパク質はATP依存的にAgo2に結合することが明らかになった。またAgo2は単体ではFLAGレジンから溶出されないことが知られていたが、天然変性タンパク質であるheat-resistant obscure(HERO)を添加することで溶出に成功した。さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合さらに、FLAGビーズに結合させたAgo2に対し、Dicer-2-R2D2、精製したシャペロンタンパク質を混合したところ、Ago2-Dicer-2-R2D2-siRNA複合体の再構成に成功した。