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細胞外膜小胞への新奇タンパク質輸送機構の解明と応用

细胞外膜囊泡新型蛋白质转运机制的阐明和应用

基本信息

批准号：
21J13113
负责人：
釜阪紘平
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Shewanella vesiculosa HM13 は約 49 kDa のタンパク質 P49 を主要な積荷とする細胞外膜小胞 (EMV) を生産する。P49 はEMV による新奇タンパク質生産系の開発のためのキャリアとして期待されている。前年度までの研究によって、P49 は II 型輸送装置様分泌装置の働きによって細胞内から汲み出され、その後 Wzx 依存的に合成される EMV の莢膜多糖成分と相互作用することで EMV へと輸送されることが分かった。しかし、依然として生理機能、構造など基本的な情報が不足していることと、融合タンパク質の生産系の構築が難航していることが課題であった。P49 の C末端領域へ変異を導入する試みによって、C 末領域は P49 の EMV 中での発現に重要であることが判明したが、タグや異種タンパク質の導入に適した部位の特定には至っていない。このためには、X 線結晶構造解析による構造情報の取得が重要である。そこで、 P49 の結晶化条件のスクリーニングを実施した。結果、精製 P49 を再現性良く結晶化する条件を発見するに至った。現在、本結晶を用いて、重原子置換法による位相決定が進行中である。同時に、P49 の生理機能についても解析を進めた。結果、P49 は EMV のゼータ電位の絶対値を上昇させ、EMV 同士の静電的な反発が強め、EMV の分散性を向上させる機能を持つことが分かった。この分散性の上昇によって、EMV の表面積が増加し、EMV と細菌細胞との相互作用が促進されると考えられた。本研究によって、P49 の EMV への輸送機構や生理機能が明らかとなり、構造解析への道も拓かれた。融合タンパク質の発現やP49 へのタグ導入に関しては現状難航しているものの、今後の発展の基礎になる成果が得られたと考える。

Shewanella vesiculosa HM13 produces a 49 kDa protein called P49, which is the main accumulation factor in extracellular membrane vesicles (EMV). P49 is a new type of EMV and a new type of quality production system. In previous studies, P49 was identified as a type II delivery device, a secretory device, and a Wzx-dependent synthesis device for the interaction of capsular polysaccharide components of EMV. The basic information of physiological function and structure is insufficient, and the quality of production system is difficult to navigate. The C-terminal domain of P49 is different from the C-terminal domain of P49. The C-terminal domain is important for the occurrence of P49 in EMV. X-ray crystallographic analysis is important for obtaining structural information. The crystallization conditions of P49 and P49 were investigated. Results: The reproducibility of purified P49 was good, and the crystallization conditions were observed. Now, this crystal is determined by the heavy atom replacement method. At the same time, the physiological function of P49 is analyzed. As a result, P49 has increased the insulation value of EMV potential, increased the electrostatic reflection of EMV and increased the dispersion of EMV. The dispersion and surface area of EMV increased, and the interaction between EMV and bacterial cells was promoted. This study focuses on the transport mechanism and physiological function of P49 EMV. The development of fusion technology and the introduction of P49 technology are related to the current situation and the future development of the foundation.