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均一粒径リポソームを用いたFoF1-ATP合成酵素の回転とプロトン輸送の同時計測

使用均匀大小的脂质体同时测量 FoF1-ATP 合酶周转和质子传输

基本信息

批准号：
21J13358
负责人：
渡邉亮
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、薬剤ターゲットとして注目される病原性マイコバクテリアのFoF1-ATP合成酵素(FoF1)に焦点を当てた。結核菌などが属するマイコバクテリアのFoF1には、生育に不利な環境下でも生存するべく、種特異的なATPase活性の阻害機構を持つ。その阻害機構について、マイコバクテリア由来FoF1のアミノ酸配列比較や構造解析から、F1部分のαサブユニットC末端の30残基程度の領域(αCTD)であることが明らかにされた。特に近年の構造解析から、αCTDがγサブユニットのloop領域と相互作用するで、FoF1のATPase活性を阻害されることが明らかにされた。このαCTD領域は抗結核薬の標的部位として注目されているが、マイコバクテリア属は培養の難しさに加え、大腸菌を用いたマイコバクテリアFoF1・F1の大量発現・精製手法が確立されていないため、一分子レベルでのαCTDの機能解析は行われていない。そこで本研究は、このマイコバクテリアFoF1に特有な領域αCTDを、取り扱いが容易な好熱菌由来F1(TF1)に実装し、マイコバクテリア由来FoF1に特有なαCTD阻害を再現することを目指した。まずTF1の回転軸γをマイコバクテリア由来F1(MsF1)のγに交換した。この変異体F1に対してさらにそのαのC末端にMsF1のαCTD領域を導入したところ、αCTDの有無によるATPase活性の差異は見られなかった。そこでこの回転軸γについて、MsF1のγに結合しているεサブユニットを導入したところ、αCTD領域を含む変異体は、αCTD領域を含まない変異体よりも約10倍程度、ATPase活性が減少することを発見した。つまり本研究で、種特異的なF1のATPase活性制御機構を、別種F1上で再現することに成功した。この成果は、病原性バクテリアF1を標的とした薬剤スクリーニングに応用できると期待できる。

This year, the focus of the pathogenic enzyme FoF1-ATP synthase (FoF1) is on the disease. TB bacteria can survive in adverse environments and maintain species-specific ATPase activity inhibitors. The structure analysis of F1 and the domain of 30 residues at the C-terminal of F1 part (αCTD) were compared. In particular, structural analysis in recent years has revealed that αCTD and γ CTD interact with each other in the loop domain and inhibit the activity of FoF1 ATPase. The target site of anti-tuberculosis agent in αCTD domain was observed, and it was difficult to culture and purify a large amount of FoF1·F1 in Escherichia coli. In this study, the unique domain αCTD of FoF1 was found to be easy to extract from F1(TF1), and the unique domain αCTD of FoF1 was found to be easy to reproduce. The reverse axis γ of TF1 is derived from γ of F1(MsF1). The difference in ATPase activity between the α-terminal region of MsF1 and the α-terminal region of MsF1 was observed. In addition, the enzyme activity of MsF1 was reduced by about 10 times in the α-CTD domain. In this study, species-specific mechanisms controlling ATPase activity in F1 were successfully reproduced in F1 of other species. The results of this study are as follows: 1. Pathogenic virus F1 is the target of infection.