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オンサイトで迅速に利用可能な核酸抽出不要の微生物解析技術の開発

开发可现场快速使用、无需核酸提取的微生物分析技术

基本信息

批准号：
21K04328
负责人：
川上周司
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Nagaoka National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

水環境中の細菌群において、その存在数をモニタリングする方法としてはrRNA遺伝子やtuf遺伝子の遺伝子数を定量するreal-time PCR法がある。しかしながら遺伝子定量を行うためには細菌の細胞からDNAを取り出す必要があり、さまざまな種類の細胞構造から普遍的にDNAを抽出することが難しいことから、その測定結果には抽出効率によるバイアスを含むことになる。本研究ではDNA aptamerとreal-time PCR法を組み合わせることでDNA抽出を介さずに試料中の任意の細菌数を定量できないかと考えた。本研究では、初期検討として、段階希釈で作成した存在数の異なる細菌サンプルを作成し、それらに結合したaptamerの数をreal-time PCRで計測することで開発を目指す技術の実現可能性を検討した。段階希釈したE.coliに対しP12-55 aptamerを結合させ、熱変性によって剥がしたaptamerの数をreal-time PCRで計測した。結果、すべてのサンプルからaptamerの検出に成功した。ただ、初期菌体量とPCR増幅の立ち上がりにおけるサイクル数 (Ct値) の両者間には、通常の遺伝子定量時における検量線サンプルで見られるような均等な間隔での立ち上がりにはならなかった。これは細菌の段階希釈において細胞固定を行わなかったことが原因であると思われ、実験過程の中でも細菌の増殖が見られたことなどが要因と考えられる。それでも10^8 cell/mLが最も増幅曲線の立ち上がりが早く、段階希釈に応じてその立ち上がりは遅くなっていく傾向が見えた。このことから、初期菌体量とaptamerの量には相関がみられ、細菌数を定量できる可能性を示すものと判断した。

Methods for Quantifying the Number of Bacteria in Aquatic Environment by Real-time PCR DNA extraction from bacterial cells is necessary for the quantification of DNA. In this study, DNA aptamer and real-time PCR were used to detect and quantify the number of bacteria in the sample. In this study, we investigated the possibility of developing a novel technique for detecting the presence of different numbers of bacteria in the early stages of detection and for real-time PCR detection of aptamers. E.coli P12-55 aptamers were detected by real-time PCR. As a result, the aptamer search was successful. The number of cells in the initial stage of PCR amplification is increased, and the number of cells in the initial stage of PCR amplification is increased. The reason for the growth of bacteria is that they are not able to survive. The maximum amplitude curve is 10^8 cell/mL, and the maximum amplitude curve is 10^8 cell/mL. The number of aptamers and the number of bacteria in the initial stage are related to each other.