Structural analysis of L-amino acid oxidases with strict substrate specificity

具有严格底物特异性的 L-氨基酸氧化酶的结构分析

• 批准号: 21K05278
• 负责人: 稲垣 賢二
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05278/
• 关键词: L-リシン酸化酵素; L-グルタミン酸酸化酵素; 基質認識機構; 成熟化機構; 飽和変異; X線結晶構造解析; L-glutamate oxidase; L-lysine oxidase; processing; substrate specificity; biosensor

放線菌L-グルタミン酸酸化酵素（LGOX）は基質特異性が厳格なため，バイオセンサーとして世界的に利用されている。LGOXの特徴である高基質特異性の要因解明のため，リガンド非結合状態のLGOXの構造解析，ドッキングスタディ，変異酵素の構造解析を通じ，活性中心残基の機能解析と役割の考察を行ってきた．その結果活性中心残基の中で，Arg305が鍵残基であることTrp564及びGlu617の3残基が厳格な基質認識に重要であることがわかった．今回より詳細な基質認識機構を明らかにすることを目的として，LGOXと基質L-Gluの複合体と変異酵素E617Q-LGOXのX線結晶構造解析を行い，基質非結合の構造と比較解析した．2段階のカラム精製を行った高純度酵素サンプルを用いて結晶化・構造解析を行った結果，長年未解明であったLGOXの基質複合体構造を明らかにできた．鍵残基のArg305に加え，His312が基質側鎖カルボキシ基と相互作用しており，この2残基が基質の側鎖認識に重要であることがわかった．さらにGlu617とAsp433がArg305と相互作用しており，Arg305の位置を固定していることがわかった. 以上4対の水素結合からなるネットワークが基質結合時に形成されており，厳格な基質認識に寄与していると考えられる．基質非結合の構造と比較したところ，Asp319－Trp327で構成されるループ構造が，基質結合状態では基質ポケットを覆うように移動していることがわかった．これによりLGOXは基質L-Gluを保持しやすく，高い反応性を示していると考えられた．以上の結果より，基質の側鎖認識を担うArg305，His312を含む水素結合ネットワークと，基質ポケットを覆うように移動するループ構造といった構造的特徴が，本酵素のL-Gluに対する厳格な基質特異性と高い反応性をもたらすと考えられる．

Actinomycetes L - グ ル タ ミ ン acid acidification enzyme (LGOX) は substrate specificity が 厳 lattice な た め, バ イ オ セ ン サ ー と し て world に using さ れ て い る. LGOX の, 徴 で あ る high substrate specificity の will interpret の た め, リ ガ ン ド a combination state の LGOX の structure, ド ッ キ ン グ ス タ デ ィ, - isoenzymes の structure を じ, active center residues の function analytical と battle line cut の investigation を っ て き た. そ の results in the active center residues の で, Arg305 が key residues で あ る こ と Trp564 and び Glu617 の 3 residues が な 厳 lattice matrix know に important で あ る こ と が わ か っ た. Today back よ り know detailed な matrix organization を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て, LGOX と matrix L - Glu の complex と - isoenzymes E617Q - LGOX の analytical を い, X-ray crystal structure matrix of combined with の と comparative analytic し た. Line 2 section order の カ ラ ム refined を っ た high purity enzyme サ ン プ ル を with い て crystallization, structure line を っ た result, long not interpret で あ っ た LGOX の matrix composite structure を Ming ら か に で き た. Key residues の Arg305 に え, His312 が substrate side chain カ ル ボ キ シ base と interaction し て お り, こ の 2 residues が matrix の side chain know に important で あ る こ と が わ か っ た. さ ら に Glu617 と Asp433 が Arg305 と interaction し て お り, Arg305 の fixed position を し て い る こ と が わ か っ た. 4 の seaborne water element combination か ら な る ネ ッ ト ワ ー ク が matrix when combined に form さ れ て お り, な 厳 lattice matrix know に send し て い る と exam え ら れ る. Matrix not compared with の tectonic と し た と こ ろ, Asp319 - Trp327 で constitute さ れ る ル ー プ が structure, matrix combining state で は matrix ポ ケ ッ ト を fu う よ う に mobile し て い る こ と が わ か っ た. The <s:1> れによ LGOX <s:1> matrix L-Gluを maintains the <s:1> やすく, and the high <s:1> anti応 を shows the て て ると ると examines the えられた. の above results よ り, matrix の side chain know を bear う Arg305, His312 を water containing む element combination ネ ッ ト ワ ー ク と, matrix ポ ケ ッ ト を fu う よ う に mobile す る ル ー プ tectonic と い っ た structure of 徴 が, this enzyme の L - Glu に す seaborne る 厳 lattice な high substrate specificity と い anti 応 sex を も た ら す と exam え ら れ る.

项目成果

高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの活性中心残基Glu617への変異導入による機能解析

通过将突变引入高度底物特异性 L-谷氨酸氧化酶的活性中心残基 Glu617 进行功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 角菜々子;渡邉和則;阿部由佳;北松瑞生;大槻高史;KIDOKORO Shun-ichi;矢野佳果，松尾慎作，伊藤菜奈子，今田勝巳，日下部均，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 矢野佳果，松尾慎作，伊藤菜奈子，今田勝巳，日下部均，根本理子，田村隆，稲垣賢二

高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの側鎖認識に関わる残基の機能解析

参与高度底物特异性 L-谷氨酸氧化酶侧链识别的残基的功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: Nakamasu Seita;Kikuma Takashi; Hashiguchi Yuji;Tada Sato ;Sano Kanae;Ito Yukishige;Takeda Yoichi;中山夏女，矢野佳果，上田悠加，今田勝巳，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 中山夏女，矢野佳果，上田悠加，今田勝巳，田村隆，稲垣賢二

鞍掛豆 西山浸98-5由来L-メチオニンγリアーゼの発現精製と性質検討

Kurakake 大豆 Nishiyama-ni 98-5 的 L-蛋氨酸 γ-裂解酶的表达纯化及性质研究

• 发表时间: 2021
• 作者: 早乙女 友規; Sawaros Onchaiya;城所 俊一;黒田 裕;S. Takahashi;大川敦司，手嶋琢，松井健二，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 大川敦司，手嶋琢，松井健二，根本理子，田村隆，稲垣賢二

放線菌由来L-メチオニン脱炭酸酵素の結晶構造に基づく反応機構の解析

基于放线菌L-蛋氨酸脱羧酶晶体结构分析反应机理

• 发表时间: 2021
• 作者: Takahashi Shuntaro;Sugimoto Naoki;田中亜季・中村 光伸・高田 忠雄;大川敦司，井上朝晶，尾上友基，志波智生，稲垣純子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 大川敦司，井上朝晶，尾上友基，志波智生，稲垣純子，田村隆，稲垣賢二

高基質特異性L-リシンα-オキシダーゼの基質側鎖の認識に関与する残基の機能解析

高底物特异性 L-赖氨酸 α-氧化酶底物侧链识别相关残基的功能分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 笠原隆継;Chang Tsung C;浦野清香;Pradipta Ambara R;田中克典;井川優風，若井拓哉，舟橋弘晃，渡邉和則，大槻高史;齋藤雅哉，赤井元気，松本侑也，上田悠加，松田崚汰，今田勝巳，根本理子，田村隆，稲垣賢二
• 通讯作者: 齋藤雅哉，赤井元気，松本侑也，上田悠加，松田崚汰，今田勝巳，根本理子，田村隆，稲垣賢二