新規抗腫瘍性酵素の開発と癌治療への応用

新型抗肿瘤酶的开发及其在癌症治疗中的应用

• 批准号: 13218081
• 负责人: 稲垣 賢二
• 金额: $ 2.43万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218081/
• 关键词: 抗腫瘍性酵素; ピリドキサール5'リン酸; 結晶構造解析; 部位特異的変異; 抗がん剤

多くの腫瘍細胞に対して抗腫瘍性を有する酵素L-メチオニンγ-リアーゼを遺伝子工学的手法により改変し、様々な物理的要因に対して耐性を付与することを試みた。酵素の改変にあたりまず酵素-PLP複合体の結晶構造解析を行い本酵素活性部位の詳細な立体構造情報を得た。血中における本酵素の不安定要因として1)低酵素濃度下における酵素高次構造の崩壊2)低補酵素濃度下におけるアポ酵素からのPLPの脱離3)酸化条件における酵素の酸化失活4)プロテアーゼによる消化を想定し,得られた立体構造情報に基づいて,酵素サブユニット内及びサブユニット間における新規のS-S結合の導入,イオン性相互作用の強化,プロテアーゼ,酸化反応のターゲットとなるアミノ酸残基の置換を行った変異酵素を遺伝子工学的手法により作製し,これらの要因に対する耐性を酵素に付与することを試みた。作製した種々の変異酵素の内,特にF128C, S248C(S-S導入), K6H(プロテアーゼ耐性)は野生型酵素と比較して最大で約1.3倍の高い活性を有していた。L341H(PLP-アポ酵素間の親和性強化)は活性については野生型酵素の約1/10と低いものであったが、アポ酵素とPLPとの親和性は約1.1倍に増加していた。更に酵素活性の発現に重要であるとされる活性部位のCysの置換体C116S, T(活性部位の酸化耐性)は基質メチオニンに対する特異性が低下しており,本残基を含めた基質認識ネットワークの改変により本酵素の基質特異性を更に高められる可能性が示唆された。これらの変異酵素に対する種々の安定性評価試験を行い,そこから得られた知見に基づき,抗がん剤としての利用により適した酵素への改変が可能であると考えられる。

More く の swollen sores cells に し seaborne て swollen sores sex を resistance have す る enzyme L - メ チ オ ニ ン gamma リ ア ー ゼ を but 伝 sub engineering technique に よ り change - し, others 々 な physical by に し seaborne て patience を give す る こ と を try み た. Enzyme <s:1> modification にあた まず まず enzyme-plp complex <s:1> crystal structure analysis を line にあた active site of this enzyme <e:1> detailed three-dimensional structure information を obtain た. Blood に お け る this enzyme の unrest in と し て 1) under the low concentration of enzyme に お け る enzyme high tectonic の 壊 alert 2) under low repair enzyme concentration に お け る ア ポ enzyme か ら の PLP の from 3) acidification condition に お け の acidification る enzyme inactivation 4) プ ロ テ ア ー ゼ に よ る digest を し scenarios, to ら れ た three-dimensional structure intelligence に base づ い て, enzyme サ ブ ユ ニ ッ ト and び サ ブ ユ ニ ッ ト between に お け る new rules の S - S combination の import, イ オ ン の strengthen interaction, プ ロ テ ア ー ゼ, acidification of the 応 の タ ー ゲ ッ ト と な る ア ミ ノ acid residues の line displacement を っ た - isoenzymes を but 伝 sub engineering technique に よ り as し, こ れ ら の by に す seaborne る に give patience を enzyme す る こ と み を try Youdaoplaceholder0. Cropping し た kind 々 の - isoenzymes の, trevor に F128C, S248C (S - S import), K6H (プ ロ テ ア ー ゼ patience) は wild-type enzyme と compare し て biggest で の is about 1.3 times high い active を し て い た. L341H (PLP - ア ポ の affinity between enzyme) は active に つ い て は wild-type enzyme の about 1/10 と low い も の で あ っ た が, ア ポ enzyme と PLP と の affinity は に raised し requirement by about 1.1 times て い た. More に enzyme activity <s:1> occurs に important であるとされる active site <e:1> Cys に substituent C116S T (active site の acidification patience) は matrix メ チ オ ニ ン に す seaborne る low specificity が し て お り, the residue を contains め た matrix know ネ ッ ト ワ ー ク の change - に よ り の substrate specificity of the enzyme を more high に め ら れ が る possibility in stopping さ れ た. こ れ ら の - isoenzymes に す seaborne る kind 々 の stability evaluation 価 test を い, そ こ か ら have ら れ た knowledge に base づ き, anti が ん tonic と し て の using に よ り optimum し た enzyme へ の change - が may で あ る と exam え ら れ る.

项目成果

T.Tamura, L-Y.Shu, A.Ashida, H.Tanaka, K.Inagaki: "Improvement of sinefungin-producing strain of Streptomycesincarnatus by conferring rifampicin-resistance through ultraviolet light irradiation and protoplast regeneration"Sci. Rep. Fac. Agric. Okayama Uni

T.Tamura、L-Y.Shu、A.Ashida、H.Tanaka、K.Inagaki：“通过紫外线照射和原生质体再生赋予利福平抗性，改进产辛芬净的链霉菌菌株”Sci。

稲垣賢二: "抗がん酵素メチオニンγ-リアーゼとNAD依存イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の立体構造に基づく機能解析"ビタミン. 76(印刷中). (2002)

Kenji Inagaki：“基于抗癌酶蛋氨酸 γ-裂解酶和 NAD 依赖性异丙基苹果酸脱氢酶的三维结构的功能分析”维生素 76（出版中）。

K.Inagaki, N.Ueno, T.Tamura, H.Tanaka: "Purification and characterization of acid trehalase from Acidobacterium capsulatum"J. Biosci. Bioeng. 91(2). 141-146 (2002)

K.Inagaki、N.Ueno、T.Tamura、H.Tanaka：“荚膜酸杆菌中酸性海藻糖酶的纯化和表征”J。

T.Tamura, M.Hasegawa, M.Sugimoto, K.Inagaki, H.Tanaka: "Molecular cloning of thioredoxin reductase isozymes, TrxR1 and TrxR2, from human lung adenocarcinoma cell line, NCI-H441"Biryo-eiyouso-kenkyu. 18. 149-153 (2001)

T.Tamura、M.Hasekawa、M.Sugimoto、K.Inagaki、H.Tanaka：“来自人肺腺癌细胞系 NCI-H441 的硫氧还蛋白还原酶同工酶 TrxR1 和 TrxR2 的分子克隆”Biryo-eiyouso-kenkyu。

T.Tamura, A.Kataoka, L-Y.Shu, A.Ashida, H.Tanaka, K.Inagaki: "An in vitro screening method for DNA cytosine-C5 methylase inhibitor"Natural Product Letter. (印刷中). (2002)

T.Tamura、A.Kataoka、L-Y.Shu、A.Ashida、H.Tanaka、K.Inagaki：“DNA 胞嘧啶-C5 甲基化酶抑制剂的体外筛选方法”自然产品通讯（2002 年）。