スフィンゴ脂質病の新規治療法を指向した光キャプチャーによるSMS2阻害様式の解明

通过光学捕获阐明 SMS2 抑制模式，用于鞘脂疾病的新疗法

• 批准号: 21K05303
• 负责人: 村井 勇太
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05303/
• 关键词: スフィンゴミエリン合成酵素２; 光アフィニティーラベル; クリックケミストリー; スフィンゴ脂質; 化学プローブ; スフィンゴミエリン合成酵素; ノシル; ジアジリン; 光アフィニティーラベル法; アルツハイマー病; 白血病

本年度は、昨年度作成に成功したスフィンゴミエリン合成酵素2（SMS2）選択的な阻害剤を搭載したノシルジアジリン型光アフィニティーラベル (NsPAL)プローブを用いてSMS2釣り上げ実験を実施した。NsPALプローブならびに検出タグ、光ラベル架橋時間の条件検討を幾度と行ったが、残念ながら目的であるSMS2（分子量43kDa）のバンドを検出するに至らなかった。そこで、代替案として準備していたSMS2阻害剤に直接ジアジリン基およびアルキンタグを導入した第二のアルキン型PALプローブの作成を行なった。12ステップで目的のアルキン型PALプローブの作成に成功し、またSMS2阻害活性を評価したところSMS2選択性およびIC50値:40 nM（オリジナル20 nM）を維持していることを確認した。続いて、新たに作成したPALプローブを用いて、SMS2釣り上げ実験を実施した。今回、光ラベル後の検出基導入についてはPALプローブ中のアルキンを利用したクリックケミストリーによってビオチン導入を実施した。ビオチン導入後はアビジン精製、SDS-PAGEを行い、最後にSMS2に導入してあるFLAGタグの抗体検出によって釣り上げの評価を行なった。また比較実験として、1)PALプローブのみを用いたケース、2)PALプローブと競合剤を用いたケース、3)PALプローブを用いないケースをSMS2過剰発現させたHEK293ライセートと過剰発現させていないHEK293ライセート（ネガティブコントロール）で実施した。その結果、通常のHEK293ライセートでは43kDa付近のバンドは一切確認されなかった。いっぽう過剰発現細胞ではPALプローブの有無でバンドの濃さに大きな差があり、また競合剤をいれたものは若干バンドが薄いことも確認できた。現在は、このバンドをゲル内消化し、MS/MS測定に移行している。

は this year and last year made に successful し た ス フ ィ ン ゴ ミ エ リ ン synthetic enzyme 2 (SMS2) sentaku な resistance against tonic を carry し た ノ シ ル ジ ア ジ リ ン type optical ア フ ィ ニ テ ィ ー ラ ベ ル (NsPAL) プ ロ ー ブ を with い て SMS2 り fishing on げ be 験 を be applied し た. NsPAL プ ロ ー ブ な ら び に 検 out タ グ, light ラ ベ ル bridging time 検 の conditions for a couple of degrees を と line っ た が, residual な が ら purpose で あ る SMS2 (43 kda) molecular weight の バ ン ド を 検 out す る に to ら な か っ た. そ こ で, instead of case と し て prepare し て い た SMS2 resistance against tonic に directly ジ ア ジ リ ン base お よ び ア ル キ ン タ グ を import し た second の ア ル キ ン type PAL プ ロ ー ブ の made line を な っ た. 12 ス テ ッ プ で purpose の ア ル キ ン type PAL プ ロ ー ブ の make に し success, ま た SMS2 resistance against active を review 価 し た と こ ろ SMS2 sentaku sex お よ び IC50 nt: 40 nM (オ リ ジ ナ ル 20 nM) を maintain し て い る こ と を confirm し た. 続 い て, new た に made し た PAL プ ロ ー ブ を with い て and SMS2 fishing り げ be 験 を be applied し た. After today, back light ラ ベ ル の 検 the base import に つ い て は PAL プ ロ ー ブ in の ア ル キ ン を using し た ク リ ッ ク ケ ミ ス ト リ ー に よ っ て ビ オ チ ン import を be applied し た. ビ オ チ ン after import は ア ビ ジ ン refined, sds-page を い, finally に SMS2 に import し て あ る FLAG タ グ の antibody 検 out に よ っ て り fishing on げ の review 価 を line な っ た. ま た comparison be 験 と し て, 1) PAL プ ロ ー ブ の み を with い た ケ ー ス, 2) PAL プ ロ ー ブ と co-opetition tonic を い た ケ ー ス, 3) PAL プ ロ ー ブ を with い な い ケ ー ス を SMS2 through turning 発 now さ せ た HEK293 ラ イ セ ー ト と before turning 発 now さ せ て い な い HEK293 ラ イ セ ー ト (ネ ガ テ ィ ブ コ ン Youdaoplaceholder0 トロ で) で implement た. Youdaoplaceholder0 そ result, usually <s:1> HEK293ラ セ セ トで トで った 43kDa fu jin <s:1> バ ド ド <e:1> all confirm されな った った った. い っ ぽ う before turning 発 now cells で は PAL プ ロ ー ブ の presence of で バ ン ド の thick さ に big き な poor が あ り, ま た co-opetition tonic を い れ た も の は several バ ン ド が thin い こ と も confirm で き た. Now, <s:1> バ ドをゲ ドをゲ ドをゲ ドをゲ ドをゲ digestion <s:1>, MS/MS determination に transition <s:1> て る る る.

项目成果

細菌由来セリンパルミトイル転移酵素の基質認識に関する構造学的考察

细菌丝氨酸棕榈酰转移酶底物识别的结构考虑

• 发表时间: 2022
• 作者: 生城浩子;村上大毅;高橋亜弥;竪山あすか;澤井大樹;後藤春菜;サジール クーラス;本田拓巳;村井勇太;門出健次;宮原郁子;神谷信夫;矢野貴人
• 通讯作者: 矢野貴人

キラルHPLCによる生合成3-ケトジヒドロスフィンゴシンの立体解析法の開発と代謝産物解析

手性 HPLC 和代谢物分析生物合成 3-酮二氢鞘氨醇立体化学分析方法的开发

• 发表时间: 2021
• 作者: 本田 拓巳;村井 勇太;生城 浩子;矢野 貴人;門出 健次
• 通讯作者: 門出 健次

Malabaricone C as a novel SARS-CoV-2 inhibitor from spices

Malabaricone C 作为一种来自香料的新型 SARS-CoV-2 抑制剂

• 发表时间: 2022
• 作者: Mutmainah;Yuta Murai;Sajeer Koolath;Seigo Usuki;Kohei Yuyama;Shinji Nakaoka;Michihito Sasaki;Yasuko Orba;Akihiko Sato;Yasuyuki Igarashi;Hirofumi Sawa;Kenji Monde
• 通讯作者: Kenji Monde

食品成分およびその誘導体群によるコロナウイルス感染抑制効果

食品成分及其衍生物对抑制冠状病毒感染的作用

• 发表时间: 2021
• 作者: 村井 勇太;ムトマイナー;クーラス サジール;臼杵 靖剛;湯山 耕平;中岡 慎治;佐々木 道仁;大場 靖子;佐藤 彰彦;五十嵐 靖之;澤 洋文;門出 健次
• 通讯作者: 門出 健次

スフィンゴ脂質病の治療法を指向した新規光キャプチャー創製の研究

用于治疗鞘脂疾病的新型光学捕获装置的研究

• 发表时间: 2022
• 作者: 阿部 美良乃;村井 勇太;佐藤 長緒;眞木 美帆;門出 健次
• 通讯作者: 門出 健次