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LysRタイプ転写調節因子による転写活性化初期機構の解明

阐明 LysR 型转录调节因子转录激活的初始机制

基本信息

批准号：
21K05361
负责人：
小川直人
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Shizuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、多様な芳香族化合物の分解能をもつ土壌細菌Burkholderia multivorans ATCC17616株の3-ヒドロキシ安息香酸（3-HB）分解遺伝子群を主な対象として、芳香族化合物分解遺伝子群の発現調節機構の解析を行っている。同株の3-HB分解遺伝子群は、その上流に位置するLysRタイプ転写調節因子の遺伝子mhbRの産物によって、3-HBまたはゲンチジン酸(GA)を誘導物質として、転写が活性化されることを、昨年度、明らかにしている。本年度は、このMhbR(ATCC17616)の誘導物質認識機構を調べるために、アミノ酸を置換した変異体を5つ作製し（Leu135Ala、Pro207Ala、Ser233Ala、Leu234Ala、Cys300Ala）、レポーター実験を行った。その結果、Ser233AlaとLeu234Alaの2変異体は、3-HB、GAに対して、野生型MhbRとは異なる応答パターンを示した。一方、他の3つの変異体は、野生型MhbRと比べて、3-HB存在下での転写活性化能が弱くなった。この結果から、上記の5か所のアミノ酸は、MhbRの誘導物質認識、もしくは転写活性化能に関与していると考えられた。これらは、細菌の転写調節因子による芳香族化合物の認識能に関する、新たな知見である。ゲルシフト実験に使用する、MhbR(ATCC17616)タンパク質は、昨年度まで、Capturem His-Tagged Purification Kitを使用して、簡易精製を行っていたが、本年度、新たに、His60 Ni Gravity Column Purification Kitを使って抽出手法を検討した結果、より多くのMhbR(ATCC17616)タンパク質を、より精製度が良い状態で抽出する方法を確立できた。以上より、MhbR(ATCC17616)の誘導物質認識能に関わるアミノ酸を明らかにするとともに、同タンパク質をより精製度が良い状態で抽出する方法を確立でき、MhbR(ATCC17616)のgtdAプロモーター領域への結合をより詳細に解析する実験を進める基盤を整備できた。

In this study, the main target of 3-hydroxybenzoic acid (3-HB) decomposition pathway of Burkholderia multivorans ATCC17616 was studied. The regulatory mechanism of aromatic decomposition pathway was analyzed. The 3-HB decomposition gene group of the same strain is located in the upstream position of the LysR gene and the product of the regulatory factor mhbR. 3-HB is an inducer of the 3-HB gene and an activator of the 3-HB gene. This year, the recognition mechanism of inducing substances in MhbR(ATCC17616) was adjusted to 5 different kinds of substances (Leu135Ala, Pro207Ala, Ser233Ala, Leu234Ala, Cys300Ala) and 5 different kinds of substances (Leu135Ala, Pro207Ala, Ser 233Ala, Cys300Ala). Ser233Ala, Leu234Ala, 3-HB, GA, wild-type MhbR, 2-D In the presence of MhbR and 3-HB, the activity of MhbR is weaker than that of wild type MhbR. The results of this study are as follows: 1. The induction of MhbR and MhbR is related to the activation of MhbR. This is a novel approach to understanding the role of aromatic compounds in bacteria and their regulatory factors. MhbR(ATCC17616) is available in quality, last year, CaptureHis-Tagged Purification Kit is available, simple purification is performed, this year, new, His60 Ni Gravity Column Purification Kit is available in extraction method, results are discussed, and MhbR(ATCC17616) is available in quality, and extraction method is established in fine condition. The above, MhbR(ATCC17616) induced substance recognition ability related to the development of the acid, the same quality, the fine system to a good state of extraction method to establish, MhbR(ATCC17616) gtdA development of the field of combination, detailed analysis, the development of the base plate preparation.