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生体認識配糖体生産のための特異的糖鎖遊離酵素の新規ドメイン解析とその機能開発

用于生物识别糖苷生产的特定聚糖释放酶的新结构域分析和功能开发

基本信息

批准号：
21K05396
负责人：
伊藤和央
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Osaka Metropolitan University (2022)Osaka City University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2021年度は、N末端側のTM領域を欠いた野生型エンドHS（Wild）とそのC末端側から順次欠失した6種類の欠失変異型エンドHS（DM-1～DM-6）の発現系を構築した。各発現酵素のアミノ酸領域は、Wild（30～1009）、DM-1（30～966）、DM-2（30～906）、DM-3（30～883）、DM-4（30～861）、DM-5（30～811）、DM-6（30～708）である。本年度は、各発現系の発現条件を検討した。その結果、10μM　IPTG添加による発現誘導下、20℃において20時間の培養によって1リットルの培養液の菌体に、400～2500 mgの野生型あるいは欠失変異型エンドHSが発現した。発現した各欠失変異型エンドHSについて、2本鎖コンプレックス型糖鎖を結合しているヒトトランスフェリンからの糖鎖遊離活性を野生型酵素の活性と比較した。その結果、欠失変異型酵素DM-1とDM-2の活性は野生型酵素の活性と同程度であった。一方、DM-3、DM-4、DM-5およびDM-6からは活性が検出されなかった。また、ハイマンノース型糖鎖を結合しているウシリボヌクレアーゼからの糖鎖遊離活性は野生型および欠失変異型酵素いずれからも検出されなかった。DM-1とDM-2は、エンドHSの構成ドメインI～VのうちドメインVを部分的あるいはすべて欠失している。これらは野生型酵素と同程度の活性を示すことから、ドメインVはエンドHSの活性には関与しないものと考えられた。一方、DM-3とDM-４はドメインIVを部分的に欠失し、DM-6はすべて欠失しドメインI、IIおよびIIIのみから構成されている。このため、エンドHSの活性発現にはドメインIVの存在が必須で、触媒領域が存在すると考えられるドメインIおよびドメインIIとIIIが構成する構造ではエンドHSの活性は発現しないものと考えられた。

2021年度はN末端側のTM領域を欠いた野生型エンドHS(野生)とそのC末端側から順次欠失した6種類の欠失変異型エンドHS (DM-1 ~ DM-6)の発現系を構築した。各発現酵素のアミノ酸領域は,野生(30 ~ 1009),DM-1 (30 ~ 966), DM-2 (30 ~ 906), DM-3 (30 ~ 883), DM-4 (30 ~ 861), DM-5 (30 ~ 811), DM-6(30 ~ 708)である。【中文翻译】、、、、、その結果10μM IPTG添加による発現誘導下,20℃において20時間の培養によって1リットルの培養液の菌体に,400 ~ 2500毫克の野生型あるいは欠失変異型エンドHSが発現した。発現した各欠失変異型エンドHSについて,2本鎖コンプレックス型糖鎖を結合しているヒトトランスフェリンからの糖鎖遊離活性を野生型酵素の活性と比較した。。一方,DM-3、DM-4 DM-5およびDM-6からは活性が検出されなかった。また,ハイマンノース型糖鎖を結合しているウシリボヌクレアーゼからの糖鎖遊離活性は野生型および欠失変異型酵素いずれからも検出されなかった。DM-1とDM-2は,エンドHSの構成ドメインI ~ VのうちドメインVを部分的あるいはすべて欠失している。これらは野生型酵素と同程度の活性を示すことから,ドメインVはエンドHSの活性には関与しないものと考えられた。一方,DM-3とDM-4はドメインIVを部分的に欠失し,DM-6はすべて欠失しドメインI, IIおよび三世のみから構成されている。このため,エンドHSの活性発現にはドメインIVの存在が必須で,触媒領域が存在すると考えられるドメイン我およびドメインIIとIIIが構成する構造ではエンドHSの活性は発現しないものと考えられた。