魚類L-アミノ酸オキシダーゼの免疫調節機能：ROSシグナリング起点としての役割

鱼类 L-氨基酸氧化酶的免疫调节功能：作为 ROS 信号源的作用

• 批准号: 21K05770
• 负责人: 木谷 洋一郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05770/
• 关键词: 魚類自然免疫; L-アミノ酸オキシダーゼ; 抗菌タンパク質; 魚類; 過酸化水素; ROSシグナル; ゼブラフィッシュ; 生体防御物質; 自然免疫; ROSシグナリング

当該年度においてはL-アミノ酸オキシダーゼとその関連遺伝子の生体防御に関わる役割を推定するために野生型ゼブラフィッシュに対して魚病細菌エドワジェラ・タルダ暴露実験を行った。ゼブラフィッシュ飼育水槽に前述の供試菌を懸濁させ，12時間および48時間飼育後に鰓を採取した。鰓からトータルRNAを抽出しこれを逆転写酵素によりcDNAとした。鋳型cDNAについてゼブラフィッシュゲノム情報から設計したゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼ特異的プライマーを用いて定量PCRを行った。しかしながらL-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子について有為な発現量変化は観察されなかった。また，前年度までに開発した蛍光HPLCを用いた高感度L-アミノ酸オキシダーゼ活性測定法を利用して野生型ゼブラフィッシュ鰓抽出液における当該酵素活性測定を行ったがこれは検出されなかった。以上の結果から，ゼブラフィッシュ鰓においてはL-アミノ酸オキシダーゼは遺伝子としては発現しているものの，魚病細菌暴露による変化はなく，また通常状態でもその活性は非常に低いことが予想された。また，無細胞発現系によるリコンビナントゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼの作製を試み，これは前年度に作製したゼブラフィッシュL-アミノ酸オキシダーゼ抗体と反応することを確認した。これに加えて，ゲノム編集技術を用いたL-アミノ酸オキシダーゼノックアウトゼブラフィッシュの創出を引き続き試みており，L-アミノ酸オキシダーゼの欠損が生体防御や発生にどのように関与するか明らかとする予定である。

在今年，我们进行了一项实验，以暴露于野生型斑马鱼上的鱼类病细菌Edwajera Talda，以估计L-氨基酸氧化酶及其相关基因在生物防御中的作用。将上述测试细菌悬浮在斑马鱼饲养罐中，并在饲养12小时48小时后收集ill。从g中提取总RNA，并使用逆转录酶用作cDNA。使用斑马鱼基因组信息设计的斑马鱼L-氨基酸氧化酶特异性引物进行定量PCR。但是，没有观察到L-氨基酸氧化酶基因的表达水平的显着变化。此外，使用高度敏感的L-氨基酸氧化酶活性测定到上一年直至上一年开发的荧光HPLC，在野生型斑马鱼g提取物中测量了酶活性，但未检测到。基于上述结果，尽管L-氨基酸氧化酶表示为斑马鱼ill中的基因，但据预测，由于暴露于鱼类疾病细菌而不会发生变化，即使在正常情况下，其活性也很低。此外，我们尝试使用无细胞表达系统产生重组斑马鱼L-氨基酸氧化酶，并确认它与上一年产生的斑马鱼L-氨基酸氧化酶抗体反应。此外，我们仍在尝试使用基因组编辑技术来创建L-氨基酸氧化酶敲除斑马鱼，并计划阐明L-氨基酸氧化酶缺乏症如何在生物防御和发育中起作用。