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糖加水分解酵素の動的構造解析による立体反転型機構の解明

通过糖基水解酶的动态结构分析阐明立体反转机制

基本信息

批准号：
21K06077
负责人：
藤原孝彰
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

天然のハイドロゲルとして知られるバクテリアセルロース（BC）は，植物由来セルロースを凌駕する強度と保水性を有するほか，人工の合成高分子ゲルにはない生体適合性や生分解性などの優れた物性を兼ね備えている．これらの優れた特徴からBCは，人工血管や火傷被覆材などの医療用材料への用途展開が進められている．しかし BCを有効活用し，新規産業材料の開発をより一層進めるために生産性を改善することが望まれる．糖加水分解酵素CeSZはBCの生産性に関わることが知られており，CeSZの反応メカニズムを詳細に理解することは，合理的なBC生産プロセスの構築に寄与する．そこで本申請課題では，X線自由電子レーザーを用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）の手法に基づき，CeSZの動的構造情報を取得することで，CeSZによる反応の分子メカニズムを解明することを目的とする．令和4年度は主に，クライオトラップ法により，野生型CeSZと基質や反応中間体との複合体構造を得ることを目指した．バッチ法により異なるpH条件で微小結晶を作成し，反応中間体の構造を捉えることに成功した．これは，変異体を利用していないという点で従来のCeSZ-基質複合体構造とは異なり，実際の基質の反応を反映した構造情報と言える．一方，CeSZの発現量は極めて高く，大腸菌培養液1Lあたり数百ミリグラムの精製標品を得ることが可能であることから，各種実験に用いるタンパク質生産コストを軽減することができた．そこで，当初計画していなかった糖質分解酵素L/Eの構造機能解析に着手し，X線結晶構造解析の手法により，アポ型，糖鎖結合型の構造を決定することに成功した．

Natural polymers are known to have superior strength and water retention properties due to plant origin, and synthetic polymers are known to have superior biodegradability and physical properties due to plant origin. The use of artificial blood vessels and fire wound coatings and medical materials has been developed. The new industrial materials development is expected to improve productivity. Sugar hydrolysis enzyme CeSZ is related to BC production. The structure of CeSZ production enzyme is related to the understanding of CeSZ production enzyme. The object of the present application is to obtain structural information of CeSZ by means of X-ray free electron diffraction analysis (SFX). In the fourth year, the structure of the wild type CeSZ matrix and the reaction intermediate were obtained. The structure of the reaction intermediate was successfully prepared under different pH conditions. The structure of CeSZ-matrix complex is different, and the matrix reflection reflects the structural information. On the one hand, CeSZ production is extremely high, Escherichia coli culture solution 1L, hundreds of thousands of refined standard products can be obtained, and various kinds of products can be used in quality production. The structure and function analysis of glucosylcatase L/E was successfully carried out by X-ray crystallographic analysis.