糖加水分解酵素の動的構造解析による立体反転型機構の解明

天然のハイドロゲルとして知られるバクテリアセルロース（BC）は，植物由来セルロースを凌駕する強度と保水性を有するほか，人工の合成高分子ゲルにはない生体適合性や生分解性などの優れた物性を兼ね備えている．これらの優れた特徴からBCは，人工血管や火傷被覆材などの医療用材料への用途展開が進められている．しかし BCを有効活用し，新規産業材料の開発をより一層進めるために生産性を改善することが望まれる．糖加水分解酵素CeSZはBCの生産性に関わることが知られており，CeSZの反応メカニズムを詳細に理解することは，合理的なBC生産プロセスの構築に寄与する．そこで本申請課題では，X線自由電子レーザーを用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）の手法に基づき，CeSZの動的構造情報を取得することで，CeSZによる反応の分子メカニズムを解明することを目的とする．令和4年度は主に，クライオトラップ法により，野生型CeSZと基質や反応中間体との複合体構造を得ることを目指した．バッチ法により異なるpH条件で微小結晶を作成し，反応中間体の構造を捉えることに成功した．これは，変異体を利用していないという点で従来のCeSZ-基質複合体構造とは異なり，実際の基質の反応を反映した構造情報と言える．一方，CeSZの発現量は極めて高く，大腸菌培養液1Lあたり数百ミリグラムの精製標品を得ることが可能であることから，各種実験に用いるタンパク質生産コストを軽減することができた．そこで，当初計画していなかった糖質分解酵素L/Eの構造機能解析に着手し，X線結晶構造解析の手法により，アポ型，糖鎖結合型の構造を決定することに成功した．

天然のハイドロゲルとして知られるバクテリアセルロース（BC）は，植物由来セルロースを凌駕する強度と保水性を有するほか，人工の合成高分子ゲルにはない生体適合性や生分解性などの優れた物性を兼ね備えている．これらの優れた特徴からBCは，人工血管や火傷被覆材などの医療用材料への用途展開が進められている．しかし BCを有効活用し，新規産業材料の開発をより一層進めるために生産性を改善することが望まれる．糖加水分解酵素CeSZはBCの生産性に関わることが知られており，CeSZの反応メカニズムを詳細に理解することは，合理的なBC生産プロセスの構築に寄与する．そこで本申請課題では，X線自由電子レーザーを用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）の手法に基づき，CeSZの動的構造情報を取得することで，CeSZによる反応の分子メカニズムを解明することを目的とする．令和4年度は主に，クライオトラップ法により，野生型CeSZと基質や反応中間体との複合体構造を得ることを目指した．バッチ法により異なるpH条件で微小結晶を作成し，反応中間体の構造を捉えることに成功した．これは，変異体を利用していないという点で従来のCeSZ-基質複合体構造とは異なり，実際の基質の反応を反映した構造情報と言える．一方，CeSZの発現量は極めて高く，大腸菌培養液1Lあたり数百ミリグラムの精製標品を得ることが可能であることから，各種実験に用いるタンパク質生産コストを軽減することができた．そこで，当初計画していなかった糖質分解酵素L/Eの構造機能解析に着手し，X線結晶構造解析の手法により，アポ型，糖鎖結合型の構造を決定することに成功した．