Cas9タンパク質の制御によるCRISPR/Cas9オフターゲット編集の抑制

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CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術において、「意図しない変異(オフターゲット編集)」を抑制することが課題となっている。本技術のさらなる安全性の向上を目指すためには、CRISPR/Cas9システムを時空間的に精密に制御することが求められている。一方で哺乳類細胞に発現させたCas9タンパク質が比較的安定であるという報告もあることから、適切なタイミングでCas9タンパク質の発現量を調節するシステムの構築が必要であると考えられている。本研究では、Cas9タンパク質がどのように して哺乳類細胞内で安定に発現するのかその分子機構の解明を試みると共に、この知見を利用するなどして、Cas9タンパク質の哺乳類細胞内での発現量を適切かつ精密に制御するシステムの構築を目指している。今年度の研究成果は以下の通りである。1) 昨年度構築した、薬剤依存的にCas9タンパク質の発現を誘導する機構とCas9タンパク質の分解を誘導する機構を組み合わせたシステムについて、特に分解誘導の分子機構に関する検討を行い、想定されるように、E3リガーゼを介したユビキチン-プロテアソーム系によってタンパク質分解されていることを明らかにした。2) このCas9タンパク質の発現誘導機構と分解誘導機構を組み合わせたシステムについて、用いる分解タグと分解誘導剤を変えることで複数のシステムを用意した。これらを複数の細胞に導入することで、Cas9タンパク質の発現/分解誘導に関する条件検討を行い、Cas9タンパク質を精密に制御する最適な条件を見い出した。