Development of muliplex, large-scale, and high-resolution genome editing technology using multi-class CRISPR system

2022年度は、前年度に引き続き、マルチクラスCRISPRに用いるための各クラス・タイプのCRISPRシステムにおける技術基盤の更なる改良を進めた。クラス1システムにおいては、CRISPR-Cas3を用いた遺伝子ノックインの最適化を実施した。まず、ドナーベクターの構造として、ホモロジー配列の両外側にCRISPR-Cas3の標的配列を配し、挿入する遺伝子カセットがプラスミドベクターから切り出されるように設計することで、ノックインの効率が高まることを示した。また、Cas3とCascadeが単一のベクターから発現するように改良を加えたall-in-oneベクターの機能性を実証した。更に、様々なホモロジーアーム長でのノックインの検証を実施することで、効率的なノックインに必要となるホモロジー配列長を同定することに成功した。興味深いことに、必要なホモロジー配列長には、ゲノム上の標的配列のPAM側と逆側で差異が存在した。クラス2システムにおいては、過去に当グループが開発したゲノム編集の効率化技術であるLoADシステムを拡張し、従来使用していたMS2以外のRNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質以外のRNA結合タンパク質のラインナップを整備した。これらを取り入れた拡張型LoADシステムの効果を検証したところ、使用するRNAアプタマーやRNA結合タンパク質によって編集結果に違いが生じることが明らかとなった。更に、先行研究においてゲノム編集パターンを変化させることが知られているT5exo-Cas9と拡張型LoAD法を組み合わせた検証を実施した結果、編集パターンの更なる変化が生じることも示された。

2022年度は、前年度に引き続き、マルチクラスCRISPRに用いるための各クラス・タイプのCRISPRシステムにおける技術基盤の更なる改良を進めた。クラス1システムにおいては、CRISPR-Cas3を用いた遺伝子ノックインの最適化を実施した。まず、ドナーベクターの構造として、ホモロジー配列の両外側にCRISPR-Cas3の標的配列を配し、挿入する遺伝子カセットがプラスミドベクターから切り出されるように設計することで、ノックインの効率が高まることを示した。また、Cas3とCascadeが単一のベクターから発現するように改良を加えたall-in-oneベクターの機能性を実証した。更に、様々なホモロジーアーム長でのノックインの検証を実施することで、効率的なノックインに必要となるホモロジー配列長を同定することに成功した。興味深いことに、必要なホモロジー配列長には、ゲノム上の標的配列のPAM側と逆側で差異が存在した。クラス2システムにおいては、過去に当グループが開発したゲノム編集の効率化技術であるLoADシステムを拡張し、従来使用していたMS2以外のRNAアプタマーおよびMS2コートタンパク質以外のRNA結合タンパク質のラインナップを整備した。これらを取り入れた拡張型LoADシステムの効果を検証したところ、使用するRNAアプタマーやRNA結合タンパク質によって編集結果に違いが生じることが明らかとなった。更に、先行研究においてゲノム編集パターンを変化させることが知られているT5exo-Cas9と拡張型LoAD法を組み合わせた検証を実施した結果、編集パターンの更なる変化が生じることも示された。