ガングリオシドのアシル鎖構造を介した自然免疫制御メカニズムの解明

阐明神经节苷脂酰基链结构介导的先天免疫控制机制

基本信息

批准号：
21K06530
负责人：
狩野裕考
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、以下の研究成果を得ることができた。(1) 組み換え全長Casp4/11発現系の構築：これまでに、マクロファージ細胞に対するLPSおよび各種脂肪酸構造のガングリオシドGM3の共刺激によって、炎症性サイトカインIL-1aの産生量が大幅に増大または抑制されることを見出している。IL-1aは非古典的インフラマソームを介したパイロトーシスによって放出されることから、その構成因子であるCasp4/11（細胞内LPS受容体）が、各種脂肪酸構造のGM3分子種によって直接的に活性化制御を受ける可能性が考えられる。そこで、大腸菌発現系を用い、Casp4/11のHis-tag融合タンパク質発現系を構築した。リガンド認識後の自己切断活性を低減したCasp4(C258A)およびCasp11(C254A)変異体として発現させることで、リガンド結合によって誘導される多量体形成を観察可能なコンストラクトとした。宿主は、LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系を用いることで、発現宿主内における意図しない多量体形成および活性化を低減できるよう考慮した。(2) 組み換え全長Casp4/11精製系および多量体アッセイ系の確立：LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系であっても、LPS生合成中間体であるLipid-IVaは産生されることから、Affinity精製中に既報に基づいた界面活性剤による内因性代謝物洗浄ステップと、さらに界面活性剤自体の除去ステップを組み込むことで、より高純度の精製を可能にした。Affinity精製およびゲル濾過担体によるバッファー交換後のCaspase-4/11はSDS-PAGEにおいてほぼ単一バンドであり、ケミカルクロスリンクによる多量体検出アッセイにおいも単量体として得られていることが確認できた。これを用いることで、各種のスフィンゴ糖脂質分子種による多量体形成アッセイを確立した。

今年，我们能够获得以下研究结果：（1）构建重组全长CASP4/11表达系统：迄今为止，已经发现，巨噬细胞上各种脂肪酸结构的神经节苷脂GM3显着增加或抑制了炎症性细胞因子IL-1A的产生。由于IL-1A是通过非经典炎性炎症释放的，因此其构成因子CASP4/11（细胞内LPS受体）有可能由具有各种脂肪酸结构的GM3分子物种直接控制。因此，使用大肠杆菌表达系统来构建CASP4/11的HIS标签融合蛋白表达系统。通过将其表示为CASP4（C258A）和CASP11（C254A）突变体，具有降低的配体识别后自切除活性的突变体，该构建体的结构允许观察由配体结合引起的多聚体形成。使用缺乏LPS合成途径的大肠杆菌表达系统，认为宿主可以减少表达宿主内的意外多次化和激活。 (2) Establishment of a recombinant full-length Casp4/11 purification system and multimeric assay system: Even in E. coli expression systems with a defective LPS synthetic pathway, Lipid-IVa, an LPS biosynthetic intermediate, is produced, and by incorporating the endogenous metabolite washing step with a surfactant based on previously reported steps during Affinity purification, a step of removing the surfactant itself was可能，允许更高的纯度纯化。亲和力纯化和与凝胶过滤载体交换后的caspase-4/11几乎是SDS-PAGE中的单个频带，并且可以证实，通过化学交联的多聚体检测测定也作为单体获得。使用此过程，建立了使用各种糖磷脂分子物种的多聚化测定。