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ガングリオシドのアシル鎖構造を介した自然免疫制御メカニズムの解明

阐明神经节苷脂酰基链结构介导的先天免疫控制机制

基本信息

批准号：
21K06530
负责人：
狩野裕考
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、以下の研究成果を得ることができた。(1) 組み換え全長Casp4/11発現系の構築：これまでに、マクロファージ細胞に対するLPSおよび各種脂肪酸構造のガングリオシドGM3の共刺激によって、炎症性サイトカインIL-1aの産生量が大幅に増大または抑制されることを見出している。IL-1aは非古典的インフラマソームを介したパイロトーシスによって放出されることから、その構成因子であるCasp4/11（細胞内LPS受容体）が、各種脂肪酸構造のGM3分子種によって直接的に活性化制御を受ける可能性が考えられる。そこで、大腸菌発現系を用い、Casp4/11のHis-tag融合タンパク質発現系を構築した。リガンド認識後の自己切断活性を低減したCasp4(C258A)およびCasp11(C254A)変異体として発現させることで、リガンド結合によって誘導される多量体形成を観察可能なコンストラクトとした。宿主は、LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系を用いることで、発現宿主内における意図しない多量体形成および活性化を低減できるよう考慮した。(2) 組み換え全長Casp4/11精製系および多量体アッセイ系の確立：LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系であっても、LPS生合成中間体であるLipid-IVaは産生されることから、Affinity精製中に既報に基づいた界面活性剤による内因性代謝物洗浄ステップと、さらに界面活性剤自体の除去ステップを組み込むことで、より高純度の精製を可能にした。Affinity精製およびゲル濾過担体によるバッファー交換後のCaspase-4/11はSDS-PAGEにおいてほぼ単一バンドであり、ケミカルクロスリンクによる多量体検出アッセイにおいも単量体として得られていることが確認できた。これを用いることで、各種のスフィンゴ糖脂質分子種による多量体形成アッセイを確立した。

This year, the following research results were obtained. (1)Construction of the full-length Casp4/11 expression system: LPS and various fatty acid constructs were found to increase and inhibit the production of IL-1a in inflammatory cells. IL-1a is a non-classical lipid molecule, and its constituent factors, Casp4/11 (intracellular LPS receptor), and the possibility of direct activation of GM3 molecular species by various fatty acid structures, are examined. Construction of a His-tag fusion protein production system for Casp4/11 After recognition, the self-deactivation activity of Casp4(C258A) and Casp11(C254A) was reduced. The host and LPS synthesis pathway deficient Escherichia coli production system is used in the development of host, and the formation of multiple bodies and the reduction of activity are considered. (2)Establishment of the purification system of the full-length Casp4/11: Escherichia coli development system with defective LPS synthesis pathway, Lipid-IVa production, purification of Affinity, purification of endogenous metabolites, purification of interfacial active agents, and purification of high purity. Affinity purification and purification of Caspase-4/11 in SDS-PAGE to determine the amount of Caspase-4/11 in the sample A variety of sugar lipid molecules are produced in the form of polysomes.