RecQ4が制御する新たなDNA修復経路選択機構の解明

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本研究は、DNA二本鎖切断（double-strand break: DSB）修復機構を分子レベルから解明するため、DSB修復経路に関与するRecQ4の機能解析をおこなっている。昨年度に引き続き、RecQ4と相互作用することが知られているHR関連タンパク質（MRE11）やNHEJ関連タンパク質（Ku70、Ku80）の組換えタンパク質の作製をおこなった。MRE11については組換えタンパク質の作製が完了し、現在RecQ4-Nとの相互作用について解析をおこなっている。まず、MRE11の組換えタンパク質が1本鎖環状DNAに対しエンドヌクレアーゼ活性を示すこと、二本鎖DNAとの結合活性を有することが確認された。そこで、これらの活性に対するRecQ4-Nの影響を調べたところ、RecQ-Nの存在下でMRE11のエンドヌクレアーゼ活性およびDNA結合活性が抑制されることが観察された。また、MRE11とRecQ4-Nが直接結合することが確認された。Ku70については、RecQ4-Nが結合するC末端領域のうち、SAPドメインを欠失させた組換えタンパク質の作製が完了した。Ku80については大腸菌での発現用プラスミドの作製、組換えタンパク質の発現と精製が完了している。またこれまでに申請者は、RecQ4-NのNHEJに対する阻害作用に、ATMキナーゼが関与することを示唆する結果を得ている。そこで、ATMによるRecQ4-Nのリン酸化がNHEJやHRに対する阻害作用に関与するか調べるため、RecQ4-Nに存在する推定リン酸化部位をすべてアラニンに置換した非リン酸化型変異体（RecQ4-N 5A）および、すべてグルタミン酸に置換した疑似リン酸化型変異体（RecQ4-N 5D）の組換えタンパク質を作製した。今後、作製したこれらの組換えタンパク質を用いて、RecQ4-Nの機能を詳細に解析していく予定である。