エンドソーム上でEGFRの分解・リサイクルを決定する新規分子基盤

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1. gamma2サブユニットを含むAP-1複合体の機能解析。AP-1複合体のgamma2サブユニットをCRISPR-Cas9システムでノックアウトした正常網膜色素上皮由来のARPE-19細胞を複数得た。ノックアウト細胞でEGFRタンパクの発現量を解析したところ、大きな影響は観察されなかった。これは以前我々が報告したgamma1ノックダウン細胞の表現型（Oncogenesis 2021）と異なるものであった事から、gamma1を含むAP-1複合体とgamma2を含むAP-1複合体とでは機能が異なる可能性が示唆された。2. クラスリンアダプター以外の因子の解析。siRNAスクリーニングで関連因子として候補にあがった遺伝子について解析を進めた。ノックアウト細胞、ノックアウト細胞にGFP融合型遺伝子を発現させたレスキュー細胞を作製した。ノックアウト細胞ではEGFRが初期エンドソームに蓄積するのに対して、レスキュー細胞ではその表現型が戻った。今後この細胞を使用して詳細な解析を進める予定である。3. EGFR-GFPを発現する細胞の作製。EGFR低発現細胞であるMCF7細胞にEGFR（野生型、L858R、T790M+L858R）-GFPをレンチウィルスにより導入し、それらを安定に発現する細胞を作製した。EGFR活性化はp-EGFR抗体で判定した。今後この細胞を使用し、各遺伝子のノックダウンやノックアウトを行っていく予定である。4. 乳がん細胞株SKBR-3においてgamma1に対するshRNAをレンチウィルスにより導入し、安定にgamma1をノックダウンする細胞を作製した。この細胞ではEGFRタンパクの発現低下と増殖能低下が見られた。