輸血関連急性肺傷害病態解明のための基礎的研究－CTL2分子間ネットワークの解明－

CTL2/HNA3のQ154R多型（HNA3a/b）をもつレトロウィルス発現系ではCTL2/HNA3の発現量が不十分であったことが判明したため、マウス由来の細胞株ATDC5, NIH3T3にプラスミド発現系を用いてQ154R多型HNA3a/bそれぞれのCTL2/HNA3を強制発現させる高発現クローンの作出に成功した。現在これらに抗CTL2抗体を作用させin vitroのTRALI細胞モデルとしてワークさせるための条件検討を行っているが、市販の抗CTL2抗体にはマウスの内在性CTL2と交差反応するものが多く、高発現細胞特異的かつHNA3a優位にミエロペルオキシダーゼ活性を上昇させる系の確立には、さらなる検証が必要な状況であるHL60細胞にC末端Halo-tagおよびMyc-tag付きのCTL2発現プラスミドを一過性に導入して発現を確認したが、導入効率が悪く十分な量のCTL2蛋白を発現させることはできなかった。そこでアデノウィルス発現系を作成しHL60細胞とヒト末梢血由来多形核細胞（好中球を含む分画）に導入し、十分な量の発現系を作成した。この系であらためて大量調製系の検討を行っている。細胞への発現系の作成に手間取ったため、CTL2/HNA3の結合蛋白同定のため、並行して酵母を用いたツーハイブリッドシステムによるライブラリースクリーニングを行った。結果として、特異的に結合する蛋白の同定に成功した。現在CTL2の機能にどのような影響を与えるのか、作成中のin vitro TRALI細胞モデルを用いて検証中である。輸血副反応患者の残余血清の収集を継続した。症例数・検体量とも限られるため、症例数の蓄積を待って最終年度に解析に移行する予定である。

CTL2/HNA3のQ154R多型（HNA3a/b）をもつレトロウィルス発現系ではCTL2/HNA3の発現量が不十分であったことが判明したため、マウス由来の細胞株ATDC5, NIH3T3にプラスミド発現系を用いてQ154R多型HNA3a/bそれぞれのCTL2/HNA3を強制発現させる高発現クローンの作出に成功した。現在これらに抗CTL2抗体を作用させin vitroのTRALI細胞モデルとしてワークさせるための条件検討を行っているが、市販の抗CTL2抗体にはマウスの内在性CTL2と交差反応するものが多く、高発現細胞特異的かつHNA3a優位にミエロペルオキシダーゼ活性を上昇させる系の確立には、さらなる検証が必要な状況であるHL60細胞にC末端Halo-tagおよびMyc-tag付きのCTL2発現プラスミドを一過性に導入して発現を確認したが、導入効率が悪く十分な量のCTL2蛋白を発現させることはできなかった。そこでアデノウィルス発現系を作成しHL60細胞とヒト末梢血由来多形核細胞（好中球を含む分画）に導入し、十分な量の発現系を作成した。この系であらためて大量調製系の検討を行っている。細胞への発現系の作成に手間取ったため、CTL2/HNA3の結合蛋白同定のため、並行して酵母を用いたツーハイブリッドシステムによるライブラリースクリーニングを行った。結果として、特異的に結合する蛋白の同定に成功した。現在CTL2の機能にどのような影響を与えるのか、作成中のin vitro TRALI細胞モデルを用いて検証中である。輸血副反応患者の残余血清の収集を継続した。症例数・検体量とも限られるため、症例数の蓄積を待って最終年度に解析に移行する予定である。