細胞外ミトコンドリア放出を伝達ツールとした心不全病態悪化の検討及び治療への応用

本年度は、新生仔ラット培養心筋細胞からの細胞外ミトコンドリア放出と放出ミトコンドリアの障害について検討した。新生仔ラット培養心筋細胞に低酸素再酸素化(H/R)刺激を行い、培養上清を回収した。培養上清中へのミトコンドリア単体放出、あるいはエキソソーム放出を検出する目的で、MitoView green染色DiI染色を各々行った。共焦点レーザー顕微鏡で蛍光染色の確認を行ったところ、MitoView green陽性ミトコンドリア放出は認めたが、DiI陽性小粒子はほとんど認めなかった。心筋細胞への刺激条件や、染色条件を変えて検討したが、いずれも明らかなDiI陽性小粒子は認められなかった。従って、低酸素再酸素化条件では単体としてミトコンドリア放出が主だと考えられた。ミトコンドリア蛍光プローブ以外にも、培養上清中のミトコンドリア放出をミトコンドリア特異タンパクであるTom20のWesternblot法で確認した。H/R刺激後の培養上清においてTom20タンパクの含有量増加が認められた。H/R刺激後の培養上清より遠心分離法で放出ミトコンドリアの分画を得て、新たな培養心筋細胞上清に加えたところ、軽度ではあるが細胞壊死を導き自己心拍のレートの減少が認められ、心筋細胞に対する障害性が観察された。また、新生仔ラット培養心筋細胞において、H/R刺激による障害に対するホノキオールの保護効果を検討した。ホノキオール投与は心筋H/R障害に伴う細胞壊死やアポトーシス細胞死を軽減していた。ホノキオールはH/R刺激に伴う心筋細胞内酸化ストレス増強を軽減していた。その機序にミトコンドリアSIRT3の保持によるSOD2脱アセチル化及び細胞内ATPの保持が認められた。さらに、本薬剤の投与により細胞外ミトコンドリア放出も軽減されていた。

本年度は、新生仔ラット培養心筋細胞からの細胞外ミトコンドリア放出と放出ミトコンドリアの障害について検討した。新生仔ラット培養心筋細胞に低酸素再酸素化(H/R)刺激を行い、培養上清を回収した。培養上清中へのミトコンドリア単体放出、あるいはエキソソーム放出を検出する目的で、MitoView green染色DiI染色を各々行った。共焦点レーザー顕微鏡で蛍光染色の確認を行ったところ、MitoView green陽性ミトコンドリア放出は認めたが、DiI陽性小粒子はほとんど認めなかった。心筋細胞への刺激条件や、染色条件を変えて検討したが、いずれも明らかなDiI陽性小粒子は認められなかった。従って、低酸素再酸素化条件では単体としてミトコンドリア放出が主だと考えられた。ミトコンドリア蛍光プローブ以外にも、培養上清中のミトコンドリア放出をミトコンドリア特異タンパクであるTom20のWesternblot法で確認した。H/R刺激後の培養上清においてTom20タンパクの含有量増加が認められた。H/R刺激後の培養上清より遠心分離法で放出ミトコンドリアの分画を得て、新たな培養心筋細胞上清に加えたところ、軽度ではあるが細胞壊死を導き自己心拍のレートの減少が認められ、心筋細胞に対する障害性が観察された。また、新生仔ラット培養心筋細胞において、H/R刺激による障害に対するホノキオールの保護効果を検討した。ホノキオール投与は心筋H/R障害に伴う細胞壊死やアポトーシス細胞死を軽減していた。ホノキオールはH/R刺激に伴う心筋細胞内酸化ストレス増強を軽減していた。その機序にミトコンドリアSIRT3の保持によるSOD2脱アセチル化及び細胞内ATPの保持が認められた。さらに、本薬剤の投与により細胞外ミトコンドリア放出も軽減されていた。