肛門括約筋障害に対する脱分化脂肪細胞由来のexosomeを用いた筋再生治療の検討

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本年度は、前年度に引き続き、DFAT由来のexosomeが筋芽細胞分化誘導に与える影響について検討を行った。マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞を培養した。C2C12細胞をdishに播種した後、DMEM（control）群、DFAT由来exosomeを添加したDMEM群、DFAT condition medium群、exosome を除去したDFAT condition medium群の4群に分けて、継続培養を行った。培養、分化誘導したC2C12細胞を4％パラホルマリンで固定した後、一次抗体として抗マウスミオシン重鎖抗体（抗マウスF59 抗体）を、2次抗体としてAlexa-Fluor-568-conjugated ヤギ 抗マウス IgG 抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。当初、4日間の継続培養期間で検討を行っていたが、その有効性を評価するために、至適培養期間、細胞源であるDFATの継代数による検討を加えた。その結果、exosome添加DMEM群、DFAT condition medium群において、control群、exosome除去DMEM群に比べ、Nuclei number、Fusion indexはともに高い傾向がみられたが、検討項目による大きな差異を現時点で認めるには至らなかった。また、ラットの肛門括約筋障害モデルに対する検討に関して、8週齢のSprague-Dawley（SD）ラットに対し、肛門内腔側と肛門周囲の、3時、6時、9時、12時方向20μM Cardiotoxin (CTX)を100μlで局所投与する事でモデルを作製し、肛門内圧を定点測定することで、モデルの評価を行った。当初、安定したモデルの作製ができず、CTX濃度、投与量の再検討と行うに至った。その結果、500μlずつ投与する事で、安定した肛門括約筋障害を誘発する事が出来た。