Regulation of anesthetic efficacy through GABA-A R phosphorilation

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前年度に確立したNeuro2Aの安定発現細胞株を用いて、パッチクランプ条件下にてGABAによる電流応答および麻酔薬の修飾効果を解析した。安定発現細胞株はbeta３サブユニットのS408/9部分をアラニン置換したS408/9A mutantとグルタミン酸に置換したS408/9E mutantの2種類を作成した。前者は脱リン酸化、後者はリン酸化に相当する変異導入となる。これらbeta3サブユニットと、alpha１とgamma2サブユニットを共発現させ解析した。　すべて野生型であるalpha1, beta3およびgamma2サブユニットを共発現させた細胞株の反応をコントロールとして比較検討した。beta３（S408/9A ）mutant サブユニットを含むGABA-A受容体はGABA投与に反応し、抗不安薬diazepamや麻酔薬propofol存在下でGABA応答は増強した。対照的にbeta３（S408/9E）mutantサブユニットを含むGABA-A受容体は応答が減弱した。免疫組織学解析によりbeta３（S408/9A ）mutant サブユニットを含むGABA-A受容体はコントロールと同様形質膜に分布しているが、beta３（S408/9E）mutantサブユニットを含むGABA-A受容体は形質膜へ分布していないことが明らかとなり、電気生理学的結果を支持するものであった。これらのことよりbeta3サブユニットのS408/9部位リン酸化が受容体トラフィッキングを制御していることが示唆された。さらにトラッフィキング関連のタンパク質探索のため、HEK293細胞にbeta３の野生型S408/9、S408/9A mutantおよびS408/9E mutantをそれぞれ発現させ、HA-tagを利用し免疫沈降をおこなった。コントロールには見られない特異的バンドを切り出して質量分析を行い、相互作用するタンパク質を同定した。