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mTORC1制御による椎間板変性遺伝子・薬物治療法の開発

通过mTORC1调控开发椎间盘退变的基因和药物疗法

基本信息

批准号：
21K09323
负责人：
由留部崇
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09323/
关键词：
椎間板変性 mTOR オートファジー脊椎整形外科

项目摘要

我々のヒト椎間板細胞実験からmTORは細胞に必須のシグナル伝達経路である一方、mTOR複合体1（mTORC1）の選択的な抑制が椎間板変性抑止効果を示す可能性が示唆された。今回、ラット椎間板細胞でmTORC1の構成体であるRaptorへのRNA干渉（RNAi）が50.1%-60.3%のタンパク発現抑制を示し、オートファジーの亢進と細胞死・細胞老化・細胞外基質分解の抑制を認めた。mTOR/mTORC1・C2 RNAiとRictor/mTORC2 RNAiも検討したが、Raptor/mTORC1 RNAiで最も顕著な変性抑止効果が得られた。そこでより高精度に特定遺伝子の完全な排除が可能となるCRISPR-Cas9システムの導入を計画し、ヒト椎間板細胞で安定して80%以上のRAPTORタンパクの発現抑制が得られた。CRISPR-Cas9ノックアウトではRNAiノックダウンと比較し、明らかなオートファジーの亢進と細胞死・細胞老化・細胞外基質分解の抑制を認め、やはりRAPTORの選択的抑制で最も顕著であった。RAPTOR/mTORC1 CRISPR-Cas9が最も効率的に椎間板変性抑制に寄与すると考え、実験中である。並行してラット尾椎椎間板組織にRaptor/mTORC1 RNAiを導入し、Raptorの選択的な発現抑制と細胞死・細胞老化の抑制を確認した。さらにラット尾椎椎間板変性モデルを作成、RNAi導入後に変性を惹起し、変性過程の変化を観察した。Raptor/mTORC1 RNAi群で画像・組織学的変性度が低く、生体内でも椎間板変性抑止効果を有する可能性が示唆された。mTOR/mTORC1・C2 RNAi、Rictor/mTORC2 RNAi、類似の薬効を示すtemsirolimusの検討も行い、RNAi、CRISPR-Cas9、薬剤を用いた椎間板細胞・動物実験を進めていく。

We demonstrate the possibility of selective inhibition of intervertebral plate activity by mTOR and mTOR complex 1 (mTORC1). RNA interference (RNAi) in mTORC1 constructs of human intervertebral plate cells was found to be 50.1%-60.3% of the total RNA interference, and the inhibition of cell death, cell aging, and extracellular matrix decomposition was also found in human intervertebral plate cells. mTOR/mTORC1·C2 RNAi and Rictor/mTORC2 RNAi detection, Raptor/mTORC1 RNAi detection and suppression The introduction of CRISPR-Cas9 gene into intervertebral disc cells was planned to stabilize more than 80% of RAPTOR gene expression inhibition. CRISPR-Cas9 is the most important inhibitor of RAPTOR selection, especially in comparison with CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 is the most important inhibitor of RAPTOR selection. RAPTOR/mTORC1 CRISPR-Cas9 is the most effective interbody plate sex inhibitor. In parallel, Raptor/mTORC1 RNAi was introduced into the caudal intervertebral disc tissue, and the inhibition of Raptor selection and cell death and cell aging was confirmed. In addition, the changes in the process of RNAi were observed after the introduction of RNAi. Raptor/mTORC1 RNAi profile and histological variability are low, and the possibility of inhibition of intervertebral disc variability in vivo is demonstrated. mTOR/mTORC1·C2 RNAi, Rictor/mTORC2 RNAi, similar drug expression temsirolimus, RNAi, CRISPR-Cas9, drug expression temsirolimus cells, animal development