難治性口腔がんに有効な腫瘍溶解ウイルスの開発

开发有效对抗难治性口腔癌的溶瘤病毒

基本信息

批准号：
21K10130
负责人：
安田元昭
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

令和４年度は主に2つの実験を行い以下の結果を得ることができた。①アデノウイルス初期プロモーター（E1,E2,E3,E4)さらに主要後期プロモーターLuciferase上流にクローニングしたレポーター遺伝子を作成し、種々の細胞内での発現を確認した。HeLa細胞を用いて、山中４因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）の強制発現によるアデノウイルス初期遺伝子プロモーターの発現変化をLuciferase assay により検討した。この実験では、山中４因子のうちOct3/4, Sox2がE1プロモーターを有意に抑制した。Lin28AおよびNanogの強制発現はE1プロモーター活性化に影響をおよぼさなかった。また内在性Tp53が欠損しているH1299肺がん細胞を用いた実験においてはTp53とKlf4が相互作用し互いの転写因子としての作用を抑制しあうことが確認された。これまでOct3/4とSox2の共発現ががん幹細胞性の形質誘導に重要であることが報告されており、このような細胞では少なくとも野生型のE1領域を有するヒトアデノウイルスの増殖が抑制される可能性が示唆された。②線虫およびヒトBNIP3の共通アミノ酸配列に対するポリクローナル抗体の作成に成功した。この抗体によりウイルス非増殖性の齧歯類動物の正常細胞における内在性のBNIP3とｐ62の共局在を検出できる可能性が高くなった。ヒト細胞系ではヒトアデノウイルスの増殖性が著しいため、細胞形態の異常が著しく、これまでごく初期の感染ステージでのみ画像解析が可能であったが、非増殖性細胞へのウイルス感染実験でBNIP3検出が可能になったことから, 感染後期における状況について、より詳細な解析が期待できると考えている。

在2022年，我们进行了两个主要实验，并能够获得以下结果。 1）然后将腺病毒早期启动子（E1，E2，E3，E4）克隆为主要晚期启动子荧光素酶上游的记者基因，并确认它们在各种细胞中的表达。使用HeLa细胞，使用荧光素酶测定法研究了由于Yamanaka 4因子的强迫表达而引起的早期腺病毒基因启动子的表达变化。在这项实验中，Yamanaka四个因素的Oct3/4和Sox2显着抑制了E1启动子。 Lin28a和Nanog的强制表达不会影响E1启动子的激活。此外，在使用内源性TP53缺乏H1299的H1299肺癌细胞的实验中，已证实TP53和KLF4相互作用并抑制了彼此作为转录因子的作用。据报道，Oct3/4和Sox2的共表达对于癌症干细胞性状诱导很重要，这表明这种细胞可能至少抑制了至少具有野生型E1区域的人类腺病毒的增殖。 2）成功创建了针对线虫和人BNIP3的常见氨基酸序列的多克隆抗体。该抗体增加了它可以检测到病毒非增生啮齿动物正常细胞中内源性BNIP3和p62共定位的可能性。人类细胞系的人类腺病毒具有显着的扩散，导致细胞形态的显着异常，并且只有在感染的早期阶段才有可能进行图像分析，但是由于BNIP3检测在非增殖细胞中的病毒感染中已经成为可能，因此我们相信，在延迟感染的情况下，对非增殖性细胞的病毒感染进行了更详细的分析。