Cellular function analysis of a novel psoriatic pathogenesis gene, PTRF / Cavin-1, and its involvement in psoriatic pathology

点击翻译按钮获取中文摘要

昨年度に引き続き、PTRF遺伝子のintron部における、rs963986C>Gの変異導入を試みた。細胞は、正常ヒト表皮細胞の確立した細胞株として広く用いられていいるHaCaT細胞を用いた。Cas9はタンパク質として、ガイドRNAと同時にトランスフェクションを行った。また変異導入用に作成した1本鎖DNAも同時にトランスフェクションを試みた。その後細胞を限界希釈し、96wellプレートに分注した。顕微鏡下で1-2細胞のwellを選び、その後ゲノムDNAが抽出可能になるまで、細胞を増殖した。十分増殖させた細胞は、回収し、ゲノムDNA抽出用と凍結保存用に分けた。DNAを抽出後、目的領域をPCRにて増幅し、サンガーシークエンスにてDNA配列を調べた。その結果、1-13塩基ほど欠損が見られた細胞株を得ることは出来たが、目的の1塩基変異を導入できた細胞株を得ることは出来なかった。最も欠失が少ない1塩基欠失の細胞株を用い、RNAを抽出後、PTRF遺伝子及び、ゲノム上その周辺に遺伝子がコードされている、STAT1、STAT3、STAT6等の発現量をqPCR法にて調べた。その結果、野生型HaCaTと比較して、大きく発現が変化している遺伝子は見られなかった。HaCaT細胞以外の皮膚由来の細胞についても変異の有無を調べることとした。自治医科大学皮膚科学講座にて確立された、表皮由来のDJM-1細胞について、rs963986の変異を持っているか否か、確認を行った。そうすると、rs963686と同じ一塩基多型を持っていることが解った。PCRで増幅した範囲内では、他の１塩基置換は見られなかった。そのため、今後のHaCaT細胞との比較に用いることにした。