In vivo analysis of PERIOD protein interaction in mammalian circadian clock

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本研究では、これまでに、PER1とPER3との相互作用に重要な役割を果たすアミノ酸Yをin vitro実験により同定し、同アミノ酸にゲノム編集により変異を導入した培養細胞では、細胞自律的な概日時計の周期長が短縮することを見出していた。本年度は、この培養細胞においてPER1-PER3相互作用が弱まっていることを免疫沈降実験により内在レベルで確認することができた。また、初年度の細胞免疫染色実験より詳細な分析を行うため、独自に構築したAIを用いて二重染色による強制発現タンパク質の細胞内局在解析を行った。AIを用いることにより、５つの局在パターンに分けての分析が可能になるとともに、両者が十分に発現している細胞に絞って、客観的に効率よく相互の局在関係を解析することが可能となった。解析の結果、両タンパク質の核内移行は、相互に増強し合っており、アミノ酸Ｙの変異によりその機能は失われることが明らかとなった。これらの結果を受けて、当初の研究計画の目的である動物個体での実験へと進んだ。AdAMSの支援をいただき、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により、アミノ酸Y変異Per3マウスを作成した。作成に当たっては、当初導入予定であったミスセンス変異と、実際にゲノム編集培養細胞で得られた変異配列を導入した２系統を作成することとした。ジェノタイピングの結果、１系統はホモ個体として、もう１系統はキメラ個体としてF0マウスを取得できた。以上のように、本年度は細胞レベルでのPER相互作用の機能の検証を経て、変異マウス作成へと計画通り研究を進展させることができた。来年度は、作成したマウスを用いて、行動リズムや位相調節機能など個体レベルで表出する概日時計機能に関する表現型を検証し、これまでの実験結果を踏まえてその分子メカニズムについて検討する。