CRISPRを用いた新規ゲノム改変技術の開発

使用 CRISPR 开发新型基因组修饰技术

• 批准号: 20K20579
• 负责人: 西増 弘志
• 金额: $ 16.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K20579/
• 关键词: CRISPR; Cas12k

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。一方、最近発見されたCas12kはガイドRNAと複合体を形成し、ガイド配列と相補的な2本鎖DNAに結合する。Cas9と異なり、Cas12kはDNA切断活性をもたず、Tn7様トランスポゾン因子（TnsB、TnsC、TniQ）とCAST（CRISPR-associated transposase）複合体を形成し、ドナーDNA中の特定のカーゴ配列をターゲットDNAに挿入する。既知のトランスポザーゼはターゲットDNAの様々な部位にドナーDNAのカーゴ配列を挿入するのに対し、CAST複合体はCas12k-ガイドRNAの結合部位から約60塩基下流の位置にカーゴ配列を選択的に挿入する。ドナーDNAの挿入部位はガイドRNAによって規定されるため、CASTを用いることによりDSBを引き起こすことなくゲノムの狙った位置へのノックインが可能であると期待されている。しかし、Cas12k、TnsB、TnsC、TniQは新規のタンパク質であるため、CASTによるDNA転移反応の分子メカニズムは謎に包まれている。本年度は、Cas12k、ガイドRNA、標的DNA、TniQ、TnsB、TnsC、S15を混合することにより、CAST超分子複合体を再構成したのち、アフィニティービーズを用いて複合体を精製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、密度マップを取得した。得られた密度マップを用いて、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-S15-TniQ-TnsC-TnsB超分子複合体の構造決定に成功し、CASTによるRNA依存的DNA挿入メカニズムに関する知見を得た。

RNA依赖性的DNA核酸酶Cas9与CRISPR-CAS采集免疫机制有关，被广泛用作基因组编辑工具，因为它与引导RNA和裂解靶DNA形成复合物。同时，最近发现的CAS12K形成了带有指导RNA的复合物，并与双链DNA结合，这与导向序列互补。与CAS9不同，CAS12K没有DNA裂解活性，并与TN7样转座子因子（TNSB，TNSC，TNIQ）形成铸件（CRISPR相关的转座酶）复合物，并插入供体DNA中的特定货物序列到目标DNA中。已知的转座酶在目标DNA中的各个位点插入供体DNA的货物序列，而铸造复合物选择性地将货物序列插入了大约60个碱基，从CAS12K指南RNA的结合位点下游大约60个碱基。由于供体DNA的插入位点是由导向RNA定义的，因此预计使用铸件将允许敲入基因组的靶向位置，而不会引起DSB。但是，由于CAS12K，TNSB，TNSC和TNIQ是新型蛋白质，因此由铸件引起的DNA转移反应的分子机制被神秘笼罩。今年，通过混合Cas12k，Guide RNA，Target DNA，TNIQ，TNIQ，TNSB，TNSC和S15来重构铸造的超分子复合物，然后使用亲和力珠对复合物进行纯化，并使用冷冻电子显微镜进行单个粒子分析以获得密度映射。使用获得的密度图，我们成功地确定了Cas12k-guide RNA-taget DNA-S15-TNIQ-TNSC-TNSC-TNSB-TNSB超分子复合物的结构，并通过cast发现了有关RNA依赖性DNA插入机构的结构。

项目成果

Publisher Correction: Base editors for simultaneous introduction of C-to-T and A-to-G mutations

出版商更正：用于同时引入 C 到 T 和 A 到 G 突变的碱基编辑器

• DOI: 10.1038/s41587-020-0585-1
• 发表时间: 2020
• 期刊: Nature Biotechnology
• 影响因子: 46.9
• 作者: Sakata Rina C.;Ishiguro Soh;Mori Hideto;Tanaka Mamoru;Tatsuno Kenji;Ueda Hiroki;Yamamoto Shogo;Seki Motoaki;Masuyama Nanami;Nishida Keiji;Nishimasu Hiroshi;Arakawa Kazuharu;Kondo Akihiko;Nureki Osamu;Tomita Masaru;Aburatani Hiroyuki;Yachie Nozomu
• 通讯作者: Yachie Nozomu

Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme

• DOI: 10.1016/j.molcel.2020.11.035
• 发表时间: 2021-02-04
• 期刊: MOLECULAR CELL
• 影响因子: 16
• 作者: Takeda, Satoru N.;Nakagawa, Ryoya;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

MIT(米国)

麻省理工学院（美国）

Broad Institute(米国)

布罗德研究所（美国）