CRISPRを用いた新規ゲノム改変技術の開発

使用 CRISPR 开发新型基因组修饰技术

• 批准号: 20K20579
• 负责人: 西増 弘志
• 金额: $ 16.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K20579/
• 关键词: CRISPR; Cas12k

CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。一方、最近発見されたCas12kはガイドRNAと複合体を形成し、ガイド配列と相補的な2本鎖DNAに結合する。Cas9と異なり、Cas12kはDNA切断活性をもたず、Tn7様トランスポゾン因子（TnsB、TnsC、TniQ）とCAST（CRISPR-associated transposase）複合体を形成し、ドナーDNA中の特定のカーゴ配列をターゲットDNAに挿入する。既知のトランスポザーゼはターゲットDNAの様々な部位にドナーDNAのカーゴ配列を挿入するのに対し、CAST複合体はCas12k-ガイドRNAの結合部位から約60塩基下流の位置にカーゴ配列を選択的に挿入する。ドナーDNAの挿入部位はガイドRNAによって規定されるため、CASTを用いることによりDSBを引き起こすことなくゲノムの狙った位置へのノックインが可能であると期待されている。しかし、Cas12k、TnsB、TnsC、TniQは新規のタンパク質であるため、CASTによるDNA転移反応の分子メカニズムは謎に包まれている。本年度は、Cas12k、ガイドRNA、標的DNA、TniQ、TnsB、TnsC、S15を混合することにより、CAST超分子複合体を再構成したのち、アフィニティービーズを用いて複合体を精製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、密度マップを取得した。得られた密度マップを用いて、Cas12k-ガイドRNA-標的DNA-S15-TniQ-TnsC-TnsB超分子複合体の構造決定に成功し、CASTによるRNA依存的DNA挿入メカニズムに関する知見を得た。

CRISPR-Cas acquires RNA dependent DNA fragments related to immune mechanisms and forms RNA complexes. A recently discovered Cas12k DNA complex is formed by binding to complementary DNA sequences. Cas9, Cas12k DNA cleavage activity, Tn7 gene transcription factors (TnsB, TnsC, TniQ) and CAST (CRISPR-associated transposase) complex formation, DNA specific alignment, DNA insertion. It is known that CAST complexes incorporate DNA alignment at positions downstream of the Cas12k-RNA binding site from about 60 bp. The DNA insertion site is located in the RNA region. The DNA insertion site is located in the DSB region. Cas 12k, TnsB, TnsC, TniQ, DNA, DNA, DNA This year, Cas12k, TnsB, TnsC and S15 were mixed to form the CAST supramolecular complex. The structure determination of Cas12k-RNA-labeled DNA-S15-TniQ-TnsC-TnsB supramolecular complex was successfully investigated.

项目成果

Publisher Correction: Base editors for simultaneous introduction of C-to-T and A-to-G mutations

出版商更正：用于同时引入 C 到 T 和 A 到 G 突变的碱基编辑器

• DOI: 10.1038/s41587-020-0585-1
• 发表时间: 2020
• 期刊: Nature Biotechnology
• 影响因子: 46.9
• 作者: Sakata Rina C.;Ishiguro Soh;Mori Hideto;Tanaka Mamoru;Tatsuno Kenji;Ueda Hiroki;Yamamoto Shogo;Seki Motoaki;Masuyama Nanami;Nishida Keiji;Nishimasu Hiroshi;Arakawa Kazuharu;Kondo Akihiko;Nureki Osamu;Tomita Masaru;Aburatani Hiroyuki;Yachie Nozomu
• 通讯作者: Yachie Nozomu

Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme

• DOI: 10.1016/j.molcel.2020.11.035
• 发表时间: 2021-02-04
• 期刊: MOLECULAR CELL
• 影响因子: 16
• 作者: Takeda, Satoru N.;Nakagawa, Ryoya;Nureki, Osamu
• 通讯作者: Nureki, Osamu

Broad Institute(米国)

布罗德研究所（美国）

MIT(米国)

麻省理工学院（美国）