Structural and functional analysis of diverse RNA helicases involved in innate immunity

参与先天免疫的多种 RNA 解旋酶的结构和功能分析

• 批准号: 22H00403
• 负责人: 西増 弘志
• 金额: $ 27.46万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H00403/
• 关键词: RNA; 免疫; RNAヘリカーゼ; クライオ電子顕微鏡; helicase; innate immunity

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。LGP2によるMDA5:RNAフィラメント形成の促進機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いてLGP2:MDA5:RNA複合体構造の決定を目指す。本年度は、研究の遂行に必要なタンパク質、RNAの調製を行い、RNAフィラメント形成条件の予備的検討を行った。先行研究を参考に、MDA5はHis×6-SUMOタグを付加した組換えタンパク質として大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。LGP2はバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーを用いて同様に精製した。長鎖dsRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro 転写により大量合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。これらの精製したMDA5、LGP2、dsRNAを混合することにより、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体が調製できることを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。このLGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いてデータ測定を行い、予備的な電子顕微鏡画像データを取得した。

RNA binding and dissociation by ATP hydrolysis RNA is classified into multiple categories, including RIG-I, RNA is classified into multiple categories, RIG-I, RNA is classified into multiple categories, and RNA is classified into multiple categories. This research topic is to analyze the static and dynamic three-dimensional structure of electron micromirrors and high-speed atomic force micromirrors, RIG-I RNA micromirrors and multi-motion micromirrors. LGP2: MDA5:RNA Complex Formation Promoter Mechanism for the Study of LGP2:MDA5:RNA Complex Structure Determination by Electron Microscopy This year, we will conduct research on the quality of RNA, RNA modulation, and preparation of RNA formation conditions. In the first study, MDA5 was used as a reference to improve the composition of His×6-SUMO, which was purified by high purity in the presence of NiNTA, NiNTA and NiNTA. LGP2 is used to develop and refine insect cell development systems. Long-chain dsRNA is used in vitro synthesis and purification. MDA5, LGP2 and dsRNA were purified and mixed. MDA5, LGP2 and dsRNA were mixed and mixed. LGP2:MDA5:dsRNA complex is frozen instantly on the screen, and the electronic microscope TalosArctica is used to determine the middle of the screen, and the electronic microscope image is prepared.