Structural and functional analysis of diverse RNA helicases involved in innate immunity

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。LGP2によるMDA5:RNAフィラメント形成の促進機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いてLGP2:MDA5:RNA複合体構造の決定を目指す。本年度は、研究の遂行に必要なタンパク質、RNAの調製を行い、RNAフィラメント形成条件の予備的検討を行った。先行研究を参考に、MDA5はHis×6-SUMOタグを付加した組換えタンパク質として大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。LGP2はバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーを用いて同様に精製した。長鎖dsRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro 転写により大量合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。これらの精製したMDA5、LGP2、dsRNAを混合することにより、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体が調製できることを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。このLGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いてデータ測定を行い、予備的な電子顕微鏡画像データを取得した。

RNAヘリカーゼはATPの加水分解を利用し立体構造を変化させ、ATP依存的に二本鎖RNAと結合・解離する。RNAヘリカーゼは複数のタイプに分類され、そのうちRIG-I様RNAヘリカーゼは免疫機構において重要な役割を担っている。本研究課題では、クライオ電子顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いた静的・動的な立体構造解析を行い、RIG-I様RNAヘリカーゼの多様な作動メカニズムを解明する。LGP2によるMDA5:RNAフィラメント形成の促進機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を用いてLGP2:MDA5:RNA複合体構造の決定を目指す。本年度は、研究の遂行に必要なタンパク質、RNAの調製を行い、RNAフィラメント形成条件の予備的検討を行った。先行研究を参考に、MDA5はHis×6-SUMOタグを付加した組換えタンパク質として大腸菌において大量発現させ、NiNTAカラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した。LGP2はバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いて発現させ、カラムクロマトグラフィーを用いて同様に精製した。長鎖dsRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro 転写により大量合成し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。これらの精製したMDA5、LGP2、dsRNAを混合することにより、LGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体が調製できることを非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。このLGP2:MDA5:dsRNAヘテロフィラメント複合体をグリッド上で瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡TalosArcticaを用いてデータ測定を行い、予備的な電子顕微鏡画像データを取得した。