カロテノイドの細胞内イメージング技術の確立

本研究では、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡などの汎用機器で解析が可能で、簡便なカロテノイドの細胞内イメージング技術の確立を目指した。発色団結合型蛍光レポータータンパク質の作出の報告を参考に、既知のカロテノイド結合タンパク質へ変異導入し、カロテノイドが結合すると蛍光を発するカロテノイドセンサータンパク質の作出を試みた。2020年度に引き続き、2021年度には作製した変異体ライブラリーをカロテノイド産生大腸菌に導入し、変異体スクリーニングを実施した。前年度に作製したカロテノイド結合タンパク質の変異体ライブラリーでは、ウエスタンブロッティング解析の結果、組換え大腸菌で発現させた際のタンパク質レベルが十分ではない可能性が明らかになった。このため、2021年度にプラスミド構築物を再設計した。前年度に作製したライブラリーと同様に、既知のカロテノイド結合タンパク質をコードする遺伝子の全長塩基配列に対してランダム変異導入PCRを行い、変異型カロテノイド結合タンパク質のライブラリーを作製した。この際、変異導入効率の異なる複数のライブラリーを準備した。新たに作製した変異体ライブラリーを用いて、カロテノイドセンサー蛍光タンパク質のスクリーニングを継続的に遂行した。蛍光化したカロテノイド結合タンパク質のスクリーニングのため、緑色植物の光合成装置（色素タンパク質複合体）を構成する主要なカロテノイドの一種であるゼアキサンチンを合成する組換え大腸菌を用いた。2021年度には、変異型カロテノイド結合タンパク質ライブラリーを刷新するとともに、カロテノイドを合成するタンパク質発現用組換え大腸菌へのライブラリーの導入方法やスクリーニングの培養条件などの見直しを行い、安定で高効率な実験系を構築することができた。

本研究では、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡などの汎用機器で解析が可能で、簡便なカロテノイドの細胞内イメージング技術の確立を目指した。発色団結合型蛍光レポータータンパク質の作出の報告を参考に、既知のカロテノイド結合タンパク質へ変異導入し、カロテノイドが結合すると蛍光を発するカロテノイドセンサータンパク質の作出を試みた。2020年度に引き続き、2021年度には作製した変異体ライブラリーをカロテノイド産生大腸菌に導入し、変異体スクリーニングを実施した。前年度に作製したカロテノイド結合タンパク質の変異体ライブラリーでは、ウエスタンブロッティング解析の結果、組換え大腸菌で発現させた際のタンパク質レベルが十分ではない可能性が明らかになった。このため、2021年度にプラスミド構築物を再設計した。前年度に作製したライブラリーと同様に、既知のカロテノイド結合タンパク質をコードする遺伝子の全長塩基配列に対してランダム変異導入PCRを行い、変異型カロテノイド結合タンパク質のライブラリーを作製した。この際、変異導入効率の異なる複数のライブラリーを準備した。新たに作製した変異体ライブラリーを用いて、カロテノイドセンサー蛍光タンパク質のスクリーニングを継続的に遂行した。蛍光化したカロテノイド結合タンパク質のスクリーニングのため、緑色植物の光合成装置（色素タンパク質複合体）を構成する主要なカロテノイドの一種であるゼアキサンチンを合成する組換え大腸菌を用いた。2021年度には、変異型カロテノイド結合タンパク質ライブラリーを刷新するとともに、カロテノイドを合成するタンパク質発現用組換え大腸菌へのライブラリーの導入方法やスクリーニングの培養条件などの見直しを行い、安定で高効率な実験系を構築することができた。