Development of innovative platform for glycoproteomics targeting mucin

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ムチンは疾患バイオマーカー探索において極めて有望な標的であるにも関わらず、解析が難しいため広大な未開拓領域となっている。この難題に挑むためにはどのムチンタンパク質にどのような糖鎖が付加されているか、すなわちタンパク質と糖鎖の両方を網羅的に解析する手法が必要である。申請者はこれまでにムチンの分離分析法と画期的なO結合型糖鎖遊離法（脱離オキシム化法）を開発した。令和4年度は、産総研ヒト糖転移酵素ライブラリーを用いて、コア３のO型糖鎖基本構造を有するスレオニンの糖鎖伸長を行い、各糖転移酵素基質特異性を明らかにしながら各種糖鎖スレオニンを合成し、コア3糖鎖スレオニンライブラリーを調製した。ガラクトースをβ1-3結合で糖鎖伸長する良い酵素が見つからず、主としてβ1-4結合で伸長した糖鎖を合成した。他にフコースやシアル酸を伸長し糖鎖のバリエーションを増大させた。糖鎖構造の同定法については、還元β脱離で得られるアルジトール体を完全メチル化し、逆相HPLCで分離し、溶出液を全て経時的に分画した後、MALDI-QIT-TOF MSで多段階質量分析を行うと、異性体構造も含めた詳細な構造解析が可能であることが判った。混合物ではイオン化が難しい硫酸化糖鎖もこの方法で分析すると強いシグナルを与え構造解析することができた。ライブラリー構築が難しい糖鎖については、このような方法での解析が可能である。ムチンの同定法の開発については、ムチン糖ペプチドの化学的処理により断片化を検討した。得られるペプチド断片には化学修飾が起きており、プロテアーゼによる分解のような単純な加水分解ではないことが判明した。