Construct of the platform for developing antibiotics targeting Vibrio cholera NADH-ubiquinone oxidoreductase

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コレラ菌NQRの精密構造を明らかにするために、大腸菌に発現させたNQRを精製し、cryo-EM（Titan-Krios）による単粒子解析を令和3年度から実施してきた。その結果、阻害剤が結合していない酸化型NQRの構造を3.1オングストローム分解能でモデル化することに成功した。さらに、コレラ菌NQRの特異的阻害剤であるコロルミシンおよびオーラシンD-42がNqrBサブユニットに結合した状態の構造を2.7オングストローム分解能でモデル化することにも成功した。cryo-EMで明らかにしたNQRの構造は、2014年にSteuberらが発表したX-線結晶構造と極めて類似していたが、X-線結晶構造では解けていなかった多くの部分構造を全てモデル化できた。X-線結晶構造で鉄原子と帰属されていたNqrD/Eサブユニットに結合したcofactorは、1個の2Fe-2Sクラスターであることがわかった。また、X-線結晶構造で帰属したリボフラビンの位置は間違っており、NqrBサブユニットの中央部分に位置することを明らかにした。重要なことに、阻害剤が結合するNqrBサブユニットのN-末端領域は阻害剤が存在しない時にはランダムな構造を取って密度が認められないが、阻害剤が結合すると固定化されるためモデル化できた。さらに、先行研究の阻害剤の光親和性標識における拮抗試験において、不思議な結果が得られていた。すなわち、拮抗剤が存在すると標識率が増大するという現象である。阻害剤結合部位がダイナミックに構造変化することを考慮し、異なる阻害剤親和性を持つ2種類の結合部位が存在するという平衡論モデルを立てることで、この不思議な現象を説明することができた。以上の成果を論文化し、Nat. Commun. (2022, 4082)誌に発表した。