Construct of the platform for developing antibiotics targeting Vibrio cholera NADH-ubiquinone oxidoreductase

霍乱弧菌NADH-泛醌氧化还原酶抗生素开发平台的构建

• 批准号: 21H02130
• 负责人: 三芳 秀人
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02130/
• 关键词: 呼吸鎖酵素; コレラ菌; コロルミシン; ユビキノン; 抗菌剤; コレラ菌呼吸鎖酵素; NADH脱水素酵素

コレラ菌NQRの精密構造を明らかにするために、大腸菌に発現させたNQRを精製し、cryo-EM（Titan-Krios）による単粒子解析を令和3年度から実施してきた。その結果、阻害剤が結合していない酸化型NQRの構造を3.1オングストローム分解能でモデル化することに成功した。さらに、コレラ菌NQRの特異的阻害剤であるコロルミシンおよびオーラシンD-42がNqrBサブユニットに結合した状態の構造を2.7オングストローム分解能でモデル化することにも成功した。cryo-EMで明らかにしたNQRの構造は、2014年にSteuberらが発表したX-線結晶構造と極めて類似していたが、X-線結晶構造では解けていなかった多くの部分構造を全てモデル化できた。X-線結晶構造で鉄原子と帰属されていたNqrD/Eサブユニットに結合したcofactorは、1個の2Fe-2Sクラスターであることがわかった。また、X-線結晶構造で帰属したリボフラビンの位置は間違っており、NqrBサブユニットの中央部分に位置することを明らかにした。重要なことに、阻害剤が結合するNqrBサブユニットのN-末端領域は阻害剤が存在しない時にはランダムな構造を取って密度が認められないが、阻害剤が結合すると固定化されるためモデル化できた。さらに、先行研究の阻害剤の光親和性標識における拮抗試験において、不思議な結果が得られていた。すなわち、拮抗剤が存在すると標識率が増大するという現象である。阻害剤結合部位がダイナミックに構造変化することを考慮し、異なる阻害剤親和性を持つ2種類の結合部位が存在するという平衡論モデルを立てることで、この不思議な現象を説明することができた。以上の成果を論文化し、Nat. Commun. (2022, 4082)誌に発表した。

コ レ ラ bacteria NQR の precision structure を Ming ら か に す る た め に, coliform に 発 now さ せ た NQR を refined し, then the EM (Titan - Krios) に よ る 単 particle を make parsing and 3 year か ら be applied し て き た. Results, resistance against tonic が そ の combined with し て い な い acidification model NQR の tectonic を 3.1 オ ン グ ス ト ロ ー ム can decompose で モ デ ル change す る こ と に successful し た. さ ら に, コ レ ラ bacteria NQR の specific resistance against tonic で あ る コ ロ ル ミ シ ン お よ び オ ー ラ シ ン D - 42 が NqrB サ ブ ユ ニ ッ ト に combining し た state の tectonic を 2.7 オ ン グ ス ト ロ ー ム can decompose で モ デ ル change す る こ と に も successful し た. Then EM で Ming ら か に し た NQR の tectonic は, 2014 に Steuber ら が 発 table し た X-ray line crystal structure と extremely め て similar し て い た が, X-ray line crystallization structure で は solution け て い な か っ た more く の partially constructed を full て モ デ ル change で き た. X-ray crystal structure objects で iron atoms と 帰 genus さ れ て い た NqrD/E サ ブ ユ ニ ッ ト に combining し た cofactor は, 2 fe - 2 s 1 の ク ラ ス タ ー で あ る こ と が わ か っ た. ま た, X-ray line crystallization structure で 帰 genus し た リ ボ フ ラ ビ ン の position between は violations っ て お り, NqrB サ ブ ユ ニ ッ ト の central part に position す る こ と を Ming ら か に し た. Important な こ と に, resistance against tonic が combining す る NqrB サ ブ ユ ニ ッ ト の N - terminal domains exist は resistance against tonic が し な い when に は ラ ン ダ ム な tectonic を take っ て density が recognize め ら れ な い が, resistance against tonic が combining す る と immobilized さ れ る た め モ デ ル change で き た. Youdaoplaceholder0, the preliminary research on the における antagonism experiment of the <s:1> light affinity marker of the <s:1> inhibitor にお にお て, and the astonishing な results が obtained られて た た た. There is an increase in the すると identification rate が of すなわち and antagonist が, and the phenomenon of すると すると う う である exists. Resistance against one of combining site が ダ イ ナ ミ ッ ク に structure - the す る こ と を し, different な る resistance against tonic affinity を hold 2 kinds の つ combining site が exist す る と い う equilibrium theory モ デ ル を made て る こ と で, こ の incredible な phenomenon を explain す る こ と が で き た. The above <s:1> achievements を on culture に, Nat. Commun. (2022, 4082) に published た.

项目成果

クライオ電子顕微鏡を用いたコレラ菌Na+輸送性NADH-ユビキノン酸化還元酵素の構造解明

使用冷冻电子显微镜阐明霍乱弧菌 Na+ 转运 NADH-泛醌氧化还原酶的结构

• 发表时间: 2022
• 作者: 石川萌;岸川淳一;桝谷貴洋;村井正俊 ;北隅優希;Nicole L. Butler;加藤貴之;Blanca Barquera;三芳秀人
• 通讯作者: 三芳秀人

コレラ菌Na+輸送性NADH-ユビキノン酸化還元酵素におけるユビキノン側鎖の結合部位の同定

霍乱弧菌Na+转运NADH-泛醌氧化还原酶中泛醌侧链结合位点的鉴定

• 发表时间: 2022
• 作者: 石川 萌;桝谷 貴洋;村井 正俊;Nicole L. Butler;Blanca Barquera;三芳 秀人
• 通讯作者: 三芳 秀人

コレラ菌の生存に必須である呼吸鎖酵素の構造を解明 ―病原性細菌に対する新しい抗菌剤の開発研究へ貢献―

阐明霍乱弧菌生存所必需的呼吸链酶的结构 - 为针对病原菌的新型抗菌剂的研究和开发做出贡献 -

レンセラー工科大学(米国)

伦斯勒理工学院（美国）

コレラ菌NADH-ユビキノン酸化還元酵素のNa+輸送におけるユビキノン側鎖の重要性

泛醌侧链在霍乱弧菌 NADH-泛醌氧化还原酶 Na+ 转运中的重要性

• 发表时间: 2022
• 作者: 石川萌、桝谷貴洋、黒田聖奈;宇野晋平、志波智生、稲岡健ダニエル、村井正俊、Blanca Barquera、三芳秀人
• 通讯作者: 宇野晋平、志波智生、稲岡健ダニエル、村井正俊、Blanca Barquera、三芳秀人