コレラ菌由来ナトリウム輸送性ＮＡＤＨ－キノン酸化還元酵素の生物有機化学的研究

霍乱弧菌钠转运 NADH-醌氧化还原酶的生物有机化学研究

基本信息

批准号：
16J02535
负责人：
伊藤剛
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者は、独自に合成した光反応性ユビキノン（PUQ-3）を用いてコレラ菌由来のNa+-NQRに対する光親和性標識実験を行った。その結果、Na+-NQRを構成する6個のサブユニットのうち、NqrAサブユニットが特異的に標識され、”solvent-accessible cavity”と呼ばれる洞窟様の空間を構成するLeu32-Met39あるいはPhe131-Lys138の領域にユビキノン結合部位が存在することが明らかになった。一方、Na+-NQRの阻害剤としては、オーラシン類縁体のHQNOが報告されているが、その阻害活性はμMオーダーとさほど強くない。そこで、所属研究室が保有するオーラシン類のライブラリーについてスクリーニングを進め、HQNOの1000倍の阻害活性を示す化合物オーラシンD-42 (AD-42)を見出した。次に、AD-42を鋳型としてキノロン骨格、あるいは側鎖末端に光反応性基（アジド基）を導入した[125I]PAD-1と[125I]PAD-2をそれぞれ合成し、コレラ菌Na+-NQRに対する光親和性標識実験を行った。その結果、[125I]PAD-1と[125I]PAD-2は、NqrBサブユニットのN末端領域のArg43-Lys54とTrp23-Gly89をそれぞれ特異的に標識した。2014年に報告されたコレラ菌Na+-NQRの結晶構造に基づくと、ユビキノン結合部位とキノンへの電子供与体であるリボフラビンの距離は約40Åも離れており、両サブユニットの大きな構造変化を前提としない限り、RBFとユビキノンの間で電子伝達は起こり得ない。阻害剤の結合部位は、NqrAを細胞膜に固定しているNqrBのN末端領域にあったことから、阻害剤はユビキノンに対して拮抗的に作用するのではなく、N末端領域の予想される構造変化を“くさび”としてはたらいて阻害していることが示唆された。

申请人使用独立合成的光电反应性泛素酮（PUQ-3）进行了源自霍乱芽孢杆菌的Na+-NQR的光亲和力标记实验。结果，据透露，在构成Na+-NQR的六个亚基中，NQRA亚基是专门标记的，并且存在于LEU32-MET39或PHE131-LYS138区域中的泛氨基酮结合位点，该区域构成了构成洞穴的空间，该空间构成了“ solvent-access-access-cess cavity”。另一方面，据报道HQNO是Auracin类似物，是Na+-NQR的抑制剂，但其抑制活性在μm的阶面不是很强。因此，我们开始筛选一个由实验室拥有的金黄色蛋白库，并发现了一种化合物Auracin D-42（AD-42），该库表现为1000倍抑制活性，如HQNO。接下来，[125i] PAD-1和[125i] PAD-2，然后使用AD-42作为模板合成，并在侧链的末端引入了带有喹诺酮骨架或光反应性基团（Azido组），然后经过光合度标记实验的Cholerae na na na+-nqr。结果，在NQRB亚基的N末端区域中，分别将[125i] PAD-1和[125i] PAD-2分别标记为ARG43-LYS54和TRP23-GLY89。基于2014年报道的霍乱Na+-NQR的晶体结构，泛氨基结合位点和电子供体核黄素与奎诺酮之间的距离分开约40Å，并且除非假定在两个亚元素中都发生了较大的结构变化，否则不会发生电子转移。抑制剂的结合位点位于NQRB的N末端区域，将NQRA固定在细胞膜上，这表明抑制剂不对泛氨基酮的作用，而是起作用，而是作为“楔形”来抑制N-terminal区域的预期结构变化。