The molecular basis for germ cell development in teleost fish

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本研究では、魚類における生殖細胞形成に必要な分子基盤の解明が第1の目的であり、その知見を元に幅広い魚類において不妊化可能な技術開発を行うことか第2の目的である。2022年度には生殖細胞形成に必須なdnd1遺伝子の共通性の高い配列をターゲットとするgRNAを設計し、CRISPR-Cas13dシステムを用いたノックダウンにより汎用性高く魚類の不妊化が可能か検証した。魚類dnd1遺伝子(７２種８０遺伝子）において１００％マッチした標的配列は存在しなかったため、配列保存性の高い領域を選択し、魚種グループごと（例、サケ科魚類）の配列をもとに共通gRNAを設計した。そして、それらをメダカ受精卵にインジェクションし、生殖細胞の欠損を指標にノックダウンが可能か調査した。メダカdnd1に対して、１塩基のミスマッチがある魚種グループ（サケ科、カワスズメ科、マグロ属、ブリ属）のgRNAでは、ノックダウン効率は減少するもののメダカの生殖細胞の欠損を確認できたが、２塩基のミスマッチ（コイ科）があるgRNAでは、ノックダウンを確認できなかった。１塩基のミスマッチのgRNAについて、stem loop部位に変異を加えたところ、不妊化効率が上昇した。さらに、サケ科魚類共通のgRNAをニジマス受精卵にインジェクションしたところ８０％以上の効率で生殖細胞が欠損した。以上の結果からCRISPR-Cas13dシステムによるdnd1のノックダウンが養殖魚の不妊化に有効であり、さらに、本研究で設計した共通gRNA により幅広い魚種での不妊化が可能であることを示唆する。